12分的生信文章如何研究异质性

今天跟大家分享的是2019年5月发表在Sci.Adv.（IF：12.804）杂志上的一篇文章Characterizing smoking-induced transcriptional heterogeneity in the human bronchial epithelium at single-cell resolution.在文章中作者使用scRNA-Seq分析了6名从未吸烟者和6名吸烟者的支气管上皮细胞。发现了吸烟引起的支气管上皮转录异质性的特征。

Characterizing smoking-induced transcriptional heterogeneity in the human bronchial epithelium at single-cell resolution描述单细胞分辨率下吸烟引起的人支气管上皮转录异质性的特征

一.研究背景

人支气管上皮由多种不同的细胞类型组成，这些细胞类型共同防御环境侵害。尽管研究表明吸烟会改变支气管上皮的功能和形态，但对特定细胞类型和整体组织组成的确切影响尚不清楚。

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二.分析流程

三.结果解读

1.scRNA-Seq鉴定吸烟者和从未吸烟者的呼吸道支气管亚群

图1A：从6名不吸烟者和6名吸烟者的右主支气管中采集支气管刷片。然后分离支气管组织，通过流式细胞荧光分选技术（FACS）分离单细胞，并制备scRNA文库进行测序。

图1B：用t- SNE来分析细胞之间的转录组关系。

然后对每个细胞的供体吸烟状态（NS，从不吸烟；CS，吸烟者）以及支气管所有细胞类型marker gene的表达作了可视化（KRT5，基底细胞；FOXJ1 ，纤毛；SCGB1A1，棒状细胞；MUC5AC，杯状细胞；CD45，白细胞）。

图1C：使用监督分析方法LDA来识别不同的细胞簇和共表达的基因集。

图1.不吸烟者和吸烟者的支气管细胞的scRNA-Seq

图2A：LDA将数据集分为13个不同的细胞簇和19组共表达的基因。

图2B：展示了每组基因在每个细胞簇的表达情况。

图2C：总结了支气管五类细胞的marker基因的表达情况。

簇2和簇4中KRT5高表达，簇5和簇11中FOXJ1高表达，簇1和簇8中SCGB1A1高表达，而簇3中MUC5AC高表达。

图2D：计算每个簇占总细胞的百分比以及其中来自从不吸烟者和吸烟者细胞的比例。并计算每个簇的富集度（蓝色）。

在杯状细胞簇3、9、12中观察到吸烟者细胞的富集；

而在棒状细胞簇1、基底细胞簇4中观察到从未吸烟者细胞的富集。

图2.支气管簇转录组、细胞类型和吸烟状态的特征

2.纤毛细胞亚群和吸烟诱导的解毒作用

作者对纤毛细胞簇（C-5，C-11）作分析。

图3A：通过热图可视化C-5和C-11中基因集GS-2，GS-3和GS-7的表达情况。

结果发现，C-5和C-11可能代表FOXJ1+纤毛细胞功能不同的亚群。

图3B：将C-5分为不吸烟者和吸烟者子集，并且通过热图可视化其中GS-8基因的表达。

发现当前吸烟者的纤毛细胞表达了独特的转录特征。具体为：表达了编码与醛和酮代谢有关的酶的基因，如AKR1B10。

图3C：作者用UMCG队列来验证上述发现。对醛酮还原酶AKR1B10进行了免疫染色。

AKR1B10在吸烟者的呼吸道中显著高表达。

图3D：吸烟者AKR1B10 +纤毛细胞的数量显着高于从不吸烟者。

结果表明，吸烟可能会诱导纤毛细胞表达特定的解毒基因AKR1B10等。

图3.在纤毛细胞中观察到吸烟诱导AKR1B10基因高表达

3.吸烟者呼吸道中出现棒状细胞数量减少和杯状细胞数量增加

作者接着对棒状细胞簇（C-1，C-8）和杯状细胞簇（C-3）作分析。

图4A：通过热图可视化C-1,8和C-3中基因集GS-19、GS-17、GS-13和GS-1的表达情况。

最大的SCGB1A1 +细胞簇C-1绝大部分是来源于从不吸烟者的细胞。表明吸烟者的呼吸道中棒状细胞的这一亚群急剧减少。

图4B：作者同样采用UMCG队列对棒状细胞（marker：MUC5B，绿色）、杯状细胞（marker：MUC5AC，蓝色）进行免疫染色。（MN为形态正常的组织区域；GCH为明显杯状细胞增生的组织区域）

发现吸烟者的杯状细胞（蓝色）数量显著增加。

图4C-F：定量分析进一步说明吸烟可能导致棒状细胞数量减少而杯状细胞数量增加。

图4.吸烟与支气管上皮中杯状细胞数量增加而棒状细胞数量减少有关

4.在吸烟者的呼吸道中观察到先前未鉴定的PG细胞亚群

图5A：通过热图可视化C-9和C-3中基因集GS-12、GS-16、GS-15的表达情况。

CEACAM5、KRT8、MUC5AC等基因显著表达。

图5B，C：用t -SNE可视化C-3和C-9细胞以及所有细胞中的CEACAM5的表达情况。

图5D：接着作免疫染色。

吸烟者GCH组织区域内，CEACAM5 + KRT8 + MUC5AC -细胞靠近杯状细胞。所以作者将其命名为PG细胞（peri-goblet cells）。PG细胞可能是与吸烟引起的GCH相关的先前未知的支气管上皮细胞亚群。

图5.在吸烟者的呼吸道中观察到先前未鉴定的PG细胞亚群

小结

      作者使用scRNA-Seq来分析健康的不吸烟者和吸烟者的单个支气管细胞的转录组。然后使用监督机器学习算法识别了支气管亚群，并从不吸烟者和吸烟者的独立队列中对支气管组织进行了免疫染色，来验证吸烟诱导的支气管转录异质性特征：在吸烟者的呼吸道中，发现了特定于纤毛细胞的解毒代谢酶基因的表达；棒状细胞的减少而杯状细胞的增加；以及先前未发现的上皮亚群（PC细胞）的出现。

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