外泌体多组学04-外泌体sRNA转录组数据饱和度评估

文章信息

• 文献标题：Small RNA Sequencing across Diverse Biofluids Identifies Optimal Methods for exRNA Isolation
• Doi：https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.03.024
• 发表时间： 2019, Cell
• 作者：llaurent@ucsd.edu

关注重点

• 用什么方法进行数据评估？
• 评估参数是什么？
• 文章结论如何：不同样本类型需满足多少数据量可进行比如定量等分析需求？
• 饱和度与常规sRNA转录组有何不同？

文献主要结论

对5种生物液体中的10种分离exRNA的方法进行系统比较，将有助于研究人员为个别研究选择最佳的方法，其总体目标是提高一个快速增长的领域的可靠性和可重复性。

• exRNA测序的复杂性和可重复性因分离方法而异
• 反褶积显示了不同方法对exRNA载体的不同获取
• exRNA分离方法的性能因生物液体和RNA的种类而不同
• miRDaR能够定制选择最佳的exRNA分离方法

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整个文献思路

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使用生物液体样本类型

为了避免样本间差异，部分样本使用了混样样本

• plasma 血浆、serum 血清、urine 尿液：来自10名男性或女性，在Lab5进行收集
• Bile 胆汁：三名疑似患有胆管癌的捐赠者(P1–P3)和一个健康的成人捐赠者(P4)
• 在三个实验室收集了三种细胞类型的细胞培养条件培养基(CCCM)
  • human embryonic stem cells (hESCs, Lab5)
  • primary neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs, Lab2)
  • human cholangiocarcinoma cells (KMBCs, Lab6)

exRNA分离方法

对每种生物液体使用多种exRNA分离方法进行分离，分离与富集exRNA的方法总共有：Exiqon，ExoQuick，ExoRNeasy，ME，Millipore，miRCury，miRNeasy，Nor，Nor_Ami，Ultra。

各自样本类型分离细节：

• 胆汁（200 mL sample input volume）：ExoRNeasy, miRNeasy, Exiqon, Ultra, and Millipore
• CCCM (4 mL input)：ExoRNeasy, Ultra, Millipore, and ExoQuick
• serum and plasma (500 mL input)：ExoRNeasy, miRNeasy, Exiqon
• urine (500 mL input)： ExoQuick, ExoRNeasy, Homebrew, Millipore, miRNeasy, and Ultracentrifuge

不同液体类型和exRNA分离方法，RNA大小分布和产量不同

• RNA大小分布差异：所有血清和血浆样本均表现为双峰分布，在ExoQuick和ExoRNeasy样本中较短(<200nt)占优势，较长(>200nt)rna在miRNeasy样本中占优势，这两个峰在Exiqon、Nor和Nor_Ami样本中都有很好的表现。
• Ultra的结果变化最大，实验室2的样本中rna大多较短，实验室5的短rna和全长18S和28Srna，实验室6的总产量较差
• 尿液中，RNA大小分布相似，但不同方法的产量不同，ExoQuick、 Ultra和Millipore的产量低于ExoRNeasy、miRNeasy和Homebrew
• 使用RiboGreen(ThermoFisher)测量exRNA浓度，但结果显示：通过生物分析仪、qRT-PCR和小RNA序列清晰检测到的RNA，无法在RiboGreen检测到。因此，研究者不建议使用RiboGreen来定量分离exRNA

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qRT-PCR鉴定exRNA分离和定量的变异来源

采用三个miRNA，这三个miRNA都曾经在多篇文献中被报道存在于细胞分泌的外泌体中：let-7a-5p，miR-16-5p，miR-223-3p。

qRT-PCR数据采用方差分析法进行分析，变异性使用：the sum of squares divided by the total error

• bile：exRNA分离在同一个实验室中进行，差异的最大来源是样本(P1-P4)，其次是exRNA分离方法，三种miRNA之间的变异较低
• urine：exRNA分离在同一个实验室中进行，变异的最大来源是分离方法，其次是生物流体供体的性别，目标miRNA和样本的贡献可以忽略不计
• CCCM：实验室是变异性的最大来源，其次是靶miRNA、exRNA分离方法和源细胞系
• 血清和血浆：qRT-PCR数据同时采用两种方法同时进行分析，变异性的最大来源是靶标miRNA，其次是实验室和exRNA的分离方法
  • 第一种：变异因素包括生物流体类型（血清与血浆）、exRNA分离方法、靶miRNA和实验室；结果显示生物流体类型对数据的可变性影响不大
  • 第二种：添加了性别和样本（个体与合并样本）作为额外的协变量：生物流体类型、性别和样本的贡献可以忽略不计

这些结果表明：

1.当检测少量miRNAs的qRT-PCR数据时，exRNA分离方法是除CCCM外的所有生物液体变异的重要来源。

2.在所有的多实验室实验中，实验室变量对变异性的贡献显著

3.使用相同的qRT-PCR机器的两个实验室产生了最相似的结果。这一观察结果表明，qRT-PCR过程，而不是exRNA分离过程，可能是实验室间实验室变异的主要来源

4.对于CCCM和血清/血浆，靶miRNA也是变异的一个重要来源，这表明检测的三个miRNA可能携带在这些生物液体的不同成分中

使用sRNA-Seq结果

对exRNA载体样本类型的严格评估需要对更多的miRNA进行评估，从而继续对exRNA样本进行小rna测序

以下结果都在同一实验室进行，对于血浆、血清和CCCM，对来自一个实验室的三个重复exRNA分离物和来自其他实验室的一个重复进行了测序
此外：

• 由于样本类型对来自血浆和血清的qRT-PCR数据的变化没有影响，我们重点关注了这些生物液体的合并样本
• 对于胆汁，我们分析了四个样本，因为在qRT-PCR实验后，其他两个样本材料不足
• 对于尿液，所有样本来自合并后的女性和男性，一个女性样本和一个男性样本

测序文库试剂盒：The NEBNext small RNA-seq library preparation kit

测序后的相关信息在Table S2，包括样本信息，测序得到的各种值（RawCount等）

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结果显示：不同种类RNA的分布因生物液体、供体/细胞系和exRNA分离方法而不同

首先，作者统计了不同RNA种类的比对率：rRNA, miRNA, tRNA, piRNA, 其他基因组序列, 以及未必对上的reads，比较了每种生物液体类型中不同方法中每种RNA种类的百分比

• 对于胆汁，Exiqon的%miRNA显著高于所有其他的方法，而P1的%tRNA显著高于P2。RNA种类在所有细胞RNA样本中的分布相似，以rRNA序列为优势
• 对于CCCM，Ultra的%tRNA显著低于其他方法，而ExoQuick和Ultra的%miRNA显著高于ExoRNeasy和Millipore
• 血浆和血清：之间的RNA种类分布相似，miRNeasy和Ultra样本的%rRNA显著高于其他方法，ME、Millipore和miRCURY的%miRNA显著低于Exiqon、ExoQuick、ExoRNeasy、miRNeasy，Nor, and Ultra
• 尿液：总体上有很高的%tRNA，其中ExoRNeasy和Ultra方法产生最高（但仍然相当低）的%miRNA

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Small RNA-Seq 中miRNA 的结果

1.miRNA的Complexity与miRNA的测序深度相关

Complexity含义：number of miRNAs with >= 10 raw counts
miRNA的Complexity与测序深度(total miRNA read count)正相关
对于每种生物液体，Complexity会逐渐稳定在一个特定的miRNA测序深度，也即测序饱和度
不同的液体类型，饱和度不一样：

• 胆汁：180 detected miRNAs at 0.9 million total miRNA counts 对于胆汁，只有Exiqon库达到了这个饱和
• CCCM：250 miRNAs at 0.6 million total miRNA counts
• plasma：400 miRNAs at 2.5 million total miRNA counts
• serum：350 miRNAs at 2.5 million total miRNA counts
• urine：120 miRNAs at 0.1 million total miRNA counts

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1.2 利用miRNA的Complexity、表达量和重复性指标来评估exRNA分离方法的性能

对于指定的样本类型，理想的exRNA分离方法一般显示为miRNA的高产量和可重复性

为了评估所测试的exRNA分离方法的相对性能，我们对数据进行了归一化和过滤，以考虑到文库之间测序深度的差异，然后计算了5个指标：

• complexity (number of different miRNAs detected)
• mean number of detected miRNAs
• mean percentage of replicates in which a given miRNA was detected
• percent coeffificient of variance (%CV) across replicates
• a combined expression reproducibility score, which we term the integrated quality score (IQS)

由于检测到的miRNA的数量及其在技术重复中一致表达的概率取决于平均表达水平，因此根据每种生物液体和分离方法的平均miRNA表达水平(以每百万[RPM]miRNA计数表示)展示结果

对于每种生物液体/分离方法组合，每个miRNA的IQS是exRNA分离试剂盒的平均表达分位数和%CV分位数的和

在所有对给定miRNA有可测量表达的分离方法中，平均表达分位数和%CV分位数的评分范围为1-5：1为最低平均表达或最高%CV，5为最高平均表达或最低%CV

计算在至少四种方法中具有可测量表达的miRNA的IQS值

因此，对于给定的分离方法，更高的IQS表明更高的表达和更高的重现性，具有更好的分析性能

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通过比较不同exRNA分离方法中IQS值的分布，我们可以很容易地选择最佳的方法来分离目标miRNA列表或为所有miRNA。

理想的分离方法下图应该有明显的左偏斜，表明具有更高表达和重复性的miRNA比例更高。

计算第75百分位IQS(IQS75)作为左偏度的指标，并结合每种分离方法的complexity，可以对每种被测试的exRNA方法的性能进行排序

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使用这些指标，血浆和血清的检测结果相似，与其他方法相比，ME、Millipore、miRCURY、miRNeasy和Ultra与其他方法相比显示出明显较低的复杂性

除血浆中的miRCURY试剂盒外，在重复中表达的miRNAs的百分比与平均表达水平呈正相关

此外，值得一提的是：

为了使研究人员容易获得这些结果，作者开发了一个交互式网络可访问应用程序，miRDaR(基于miRNA检测和可重复性的exRNA分离方法的选择)

网址如下：https://exrna.shinyapps.io/mirdar/

此时此刻，对于文章中开头的疑问，心中应该有了答案~