基因编辑—如何降低和检测CRISPR-Cas系统脱靶效应？

CRISPR/Cas是细菌和古细菌遗传进化所衍生的获得性免疫系统，也是基因编辑领域的核心工具。由成簇间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats, CRISPR）和CRISPR相关基因（Cas）组成。虽然CRISPR/Cas基因编辑系统具有重要的应用价值，但也因为脱靶问题备受热议。本次分享将就脱靶现象的解决和检测方法做一次总结。

---

CRISPR/Cas系统及其脱靶效应

CRISPR/Cas系统具有强大的基因编辑能力，并且具有操作简单，价格低廉，效率高等优点。该系统的出现是推动基因治疗突破的重要因素之一。虽然经典的CRISPR/Cas9系统具有较多优点，却存在很高的脱靶风险——不仅切割其靶向目标位点，在具有相似序列的位置也可能会发生切割[1]。CRISPR的脱靶效应会增加疾病治疗的风险，严重阻碍进一步临床应用。所以解决CRISPR/Cas脱靶问题是该领域的重要研究方向。

降低脱靶的两大手段

CRISPR/Cas系统只需要一个靶向的gRNA (guide RNA)就能引导Cas蛋白结合到相应的基因序列，并指导切割该位点。其特异性主要由Cas蛋白和gRNA决定，因此主要从这两个方面来提高CRISPR系统的特异性。

1. 提高Cas蛋白的特异性

为了提高Cas9的特异性，科学家除了寻找Cas9同系物外[2]，还通过改造Cas9来提高CRISPR/Cas9系统的特异性：以基因工程使Cas9的双链切割作用突变为单链切割。只有2条sgRNA同时发生错配才会脱靶，就极大降低了脱靶效应。

例如将Cas9的一个酶切位点失活，得到突变型D10A Cas9切口酶和H840A Cas9切口酶[3]。或将Cas9蛋白的核酸酶结构域进行突变，产生灭活的dCas9，再与FokⅠ核酸酶结合形成融合蛋白质(Cas9-FokⅠ)[4]。能有效减少脱靶，但操作复杂性提高。所以科学家也把目光转向了gRNA。

2. 提高gRNA特异性

所有Cas9蛋白都需要gRNA引导，因而通过调整gRNA来提升特异性就适用更多情况。2014年，哈佛医学院的J. Keith Joung团队研究发现截短的gRNA (长度< 20bp)，不减少编辑效率就可以使脱靶位点减少5000倍[5]。他们还发现截短的gRNA可使成对的单链切割Cas9 酶的脱靶进一步减少。2016年J. Keith Joung团队的研究发现了新的提升特异性的方案，即SpCas9-HF1，但是截短的gRNA与该体系的结合效果较差[6]。

2019年，杜克大学的Charles 团队在gRNA添加了一条能与自身折叠形成“发卡”结构的尾巴。只在与靶向DNA序列完全匹配时才能开锁，从而精准指导核酸酶的切割。可将编辑的准确性提高50倍，最高甚至提高了200倍，大幅度降低了脱靶率[7]。

image

野生型sgRNA和发卡sgRNA的结构示意图[7]

检测CRISPR脱靶的方法

目前有很多可以设计gRNA并预测脱靶位点的网站，除了常用的elevation和CRISPOR外，还有synergizing CRISPR以及deep CRISPR等模型。

但是如何从计算机的模拟预测中挑出一个完美gRNA呢？

目前是 gRNA切割后，测序检测其脱靶位点。但是还有预测工具是否可靠，预测范围外是否脱靶，如何高通量检测脱靶位点等很多问题需要解决。所以科学家们正在积极寻找简单高效的检测CRISPR脱靶方法。

1. 细胞外检测方法

Digenome-seq

Digested genome sequencing，通过核酸酶切割提基因组DNA，高通量测序，生物信息学分析来检测脱靶情况——显然这种脱离细胞本身的检测方法无法检测真实细胞内发生的突变[8]。

CIRCLE-seq

将提取的DNA断裂成300 bp后再环化，加入gRNA和核酸酶，含有靶标序列的环形DNA会被切割成线性DNA，而没有酶切位点的环形DNA则不会。再对线性的DNA进行高通量测序，其与Digenome-seq相比，是一种更为灵敏的细胞外检测方法[9]。

image

CIRCLE-seq流程示意图

SITE-Seq

在细胞外将DNA在sgRNPs处理后进行高通量测序，该技术使用了sgRNA编程的Cas9对基因组DNA中的剪切位点序列进行识别[10]。该方法将生化识别法与细胞活性检测法相结合，具有高精高敏的脱靶位点鉴别能力。

2. 细胞内检测方法

GUIDE-seq

在细胞内通过核酸酶切割产生双链断裂后，以非同源性末端接合(Non-homologous endjoining, NHEJ)的方法，引入一种短双链寡核苷酸来标记CRISPR-Cas诱导的脱靶断裂，高通量测序找到脱靶位置[11]。该方法能很好的模拟细胞内脱靶现象，且能找到非预测范围内的脱靶位点，是一种较为可靠的方法。

image

GUIDE-Seq 方法的流程示意图[11]

DISCOVER-Seq

最近加州大学伯克利分校和阿斯利康公司的研究人员开发出一种利用DNA修复因子结合染色质免疫共沉淀和高通量测序的方法——DISCOVER-Seq。该方法不仅简化了识别脱靶效应的过程，也提高了检测准确性[12]。它是改善临床前研究和使CRISPR治疗更接近实际患者需要的关键步骤。

image

DISCOVER-Seq 工作流程[12]

GOTI

GOTI，Genome-wide Off-target analysis by Two-cell embryo Injection技术是由中国科学家和斯坦福大学的科学团队共同开发的新型脱靶检测技术。该方法应用双细胞胚胎注射gRNA和核酸酶来评估核酸酶的脱靶效应。研究者们在小鼠受精卵分裂到二细胞期时，只编辑其中一个卵裂球，并用红色荧光蛋白标记。在小鼠胚胎发育到 14.5 天时，对小鼠胚胎细胞进行流式细胞分选，分选出基因编辑细胞和未编辑细胞，再测序比较两组差异[13]。

image

GOTI 方法流程图[13]

未来方向

随着基因治疗时代的到来，更需要开发精准安全的编辑工具、监控、防止脱靶的技术。目前无论是计算机模拟，还是细胞内、外检测的方法，都没有一个金标准。笔者大胆预测，未来的趋势是计算机模拟预测，细胞水平预测，以及细胞外预测相结合。而这些技术的开发、成熟，又将让我们更快更广泛的应用基因编辑技术。

引用文献：

1. Fu Y, et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nature Biotechnology, 2013.

2. Chatterjee P, et al. Minimal PAM specificity of a highly similar SpCas9 ortholog. Science Advances, 2018.

3. Ran F A, et al. Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell, 2013.

4. Tsai S Q, et al. Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing. Nature Biotechnology, 2014.

5. Fu Y, et al. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nature Biotechnology, 2014.

6. Benjamin P. Kleinstiver, etal. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects. Nature. 2016.

7. Kocak DD, et al. Increasing the specificity of CRISPR systems with engineered RNA secondary structures. Nature Biotechnology,2019.

8. Lin J, et al. Off-target predictions in CRISPR-Cas9 gene editing using deep learning. Bioinformatics. 2018.

9. Tsai SQ, et al. CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR–Cas9 nuclease off-targets. Nature Methods, 2017.

10. Cameron P, et al. SITE-Seq: A Genome-wide Method to Measure Cas9 Cleavage. Nature. 2017.

11. Tsai S Q, et al. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases. NatureBiotechnology, 2014.

12. Beeke Wienert, et al. Unbiased detection of CRISPR off-targets in vivo using DISCOVER-Seq, Science, 2019.

13. Erwei Zuo, et al. Cytosine base editor generates substantial off-target single nucleotide variants in mouse embryos, Science, 2019.

文章转自博伦再生医学，想获取详细内容，请微信搜索：博伦再生医学