Illumina HumanMethylation450 Bea
一、Illumina HumanMethylation450 BeadChip （甲基化450k芯片）简介
Illumina最早的甲基化芯片是27K（K代表1000，表示大概可以测到的CpG位点数）的数据，后来增加到了450K（主流的甲基化芯片），而目前illumina已经出了新一代产品EPIC（我习惯称之为850K），但是技术核心在450K已经成熟了，所以分析流程这里以450K为主（也是目前数据库主流的甲基化芯片数据）。
450K芯片的芯片图形及其原理可以以下图（来源于illumina.com）展示
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</ignore_js_op>1、芯片：一张芯片包括12个array（如图显示），也就是一张芯片可以做12个sample，一台机子一次可以跑8张芯片，也就是一共96个sample，每个样本可以测到超过450，000个CpG位点的甲基化信息（大概人所有的1%，但是覆盖了多数CpG岛和启动子区），芯片本身包含一些控制探针可以做质控。
2、原理：简而言之，基于亚硫酸盐处理后的DNA序列杂交的信号探测。亚硫酸盐是甲基化探测的“金标准”，不管是芯片或者甲基化测序，都要先对DNA样品进行亚硫酸盐处理，使非甲基化的C变成U，而甲基化的C保持不变，从而在后续的测序或者杂交后区分出来。450K采用了两种探针对甲基化进行测定，Infinium I采用了两种bead（甲基化M和非甲基化U，如图显示），而II只有一种bead（即甲基化和非甲基化在一起），这也导致了它们在后续荧光探测的不同，450K采用了两种荧光探测信号（红光和绿光）。
更多信息可以在官网查看 http://www.illumina.com/products ... _beadchip_kits.html
二、分析需要考虑的问题
1、背景校正
2、红光和绿光的校正
3、控制芯片的使用（illumina450K本身有一些控制芯片，可以用来做质控，如亚硫酸盐处理效率）
4、探针类型（I型和II型）的校正（不同探针类型产生的数据不同）
这个问题我们之前关注很多，这里附上两篇文献供大家参考，最终我们选择BMIQ的方法（基于ebayes的原理将II型探针的甲基化水平拉伸到I型水平，如下图显示）来做矫正。
文献1： http://bioinformatics.oxfordjournals.org/content/29/2/189.short
文献2： http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.4161/epi.24008
图片来源于第1篇文献
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</ignore_js_op>5、位置的校正（芯片上的不同位置产生的数据可能会有偏差）
6、批次的校正（不同的批次做的数据会有偏差）
7、探针序列本身是否可靠（有些探针本身位于repeat区或者包含snp等就会影响杂交及最后的结果，应该去除，附上一片参考文献，里边有list可以用来去除不好的探针）
文献：http://bmcgenomics.biomedcentral.com/articles/10.1186/1471-2164-15-51
三、数据处理
1、GenomeStudio
GS是illumina开发的软件，基于图形界面的操作处理，适合于没有R及编程基础的人使用，但是使用GS需要权限，本人试过挺难破解的，如果有人可以破解，可以提供给论坛小伙伴使用。
2、基于R和bioconductor的pipeline
bioconductor里开发了很多package供大家使用，如果你会R，那么处理这个甲基化芯片的数据将变得简单。
可以处理450K芯片的package有lumi、minfi、wateRmelon、ChAMP等，没有哪一种就特别好，大家都在不断改进，所以只要你知道大概的流程和需要注意的问题，那么你也可以自己写代码处理，只是package可以帮你省很多事情。下边我会附上我的处理流程图和详解，还有我的代码，我的代码是基于minfi的，我再次强调，代码只是手段，你可以用其他的package（例如我的同事很多使用ChAMP），也许会更好。
流程图：
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</ignore_js_op>流程图详解：我们一般下载或者iscan后的原始数据格式为Idat，首先可以得到每个sample的每个probe的p值和bead数，根据p值和bead数可以进行样本和探针的过滤，过滤之后需要用BMIQ的方法进行I和II型探针的校正，矫正之后去掉那些包含snp之类的不好的探针，最后对数据做batch的校正。校正之后的数据就是预处理后的数据了，可以用于更下游的分析，如差异甲基化和甲基化与表达的关联分析等。
我的代码： https://github.com/wkl1990/Illumina450K-methylation，再次强调，我的代码并不完美，如果有bug，请告诉我修改，构建你自己的代码，让自己敲起来。
最后，感谢坛主大神的邀请和鼓励，他的学习和分享精神一直是我的榜样，希望在这里我可以书写和学习更多的知识，结识更多的朋友。
