文献学习051--[sc+NETs]CD177+细胞产生NETs
上个月 (22.7.5) 发在Journal of Hepatology (IF: 30.083) 上的文章。
背景：胆道闭锁是引起婴幼儿肝衰竭的常见疾病，病死率高。近年来，许多研究在胆道闭锁发病机制已经取得突破，但主要集中在适应性免疫及病程中晚期，对于病程早期引起胆管损伤的天然免疫细胞类型、作用方式及调控机制仍不清楚，且临床目前尚无治疗胆道闭锁的有效药物。在此前的研究中，作者报道了中性粒细胞在胆道闭锁biliary atresia (BA)中可能起到病理损伤作用，因此在这篇文章中作者想要去探究CD177+中性粒细胞如何参与在BA的发生发展。
1. Gr-1+ cells are sufficient to induce bile duct obstruction in RRV-inoculated neonatal NOD/SCID mice
在作者之前的一项研究中，他们证明了 Gr-1+ 细胞的缺失阻止了 BALB/c BA 小鼠模型中 BA 的发生。
Fig 1A, B： 为了探究Gr-1+ 细胞的功能是否依赖于适应性免疫，作者给 NOD/SCID 小鼠 (T B细胞缺陷鼠)腹腔注射了恒河猴轮状病毒(RRV)。结果显示49.2% (30/61) 的 NOD/SCID 鼠和 100% (50/50) 的 BALB/c 鼠出现了BA. 小鼠出现明显的黄疸和体重减轻。胆管造影术显示肝外胆道闭锁。
BALB/c 鼠注射RRV病毒是胆道闭锁的经典模型
NOD/SCID 小鼠注射RRV病毒是作者自己建的模型，说明了先天免疫在BA形成过程中也起了重要作用。
Fig 1C：流式结果显示在两种模型中，Gr-1+中性粒细胞和control相比，都升高了近三倍（两个模型的巨噬细胞在造模后出现下降，NK细胞轻度增加。BALB/c 模型鼠还出现了TB细胞的增多）。提示Gr-1+中性粒细胞可能是应对病毒感染和介导胆道损伤的主要免疫细胞群。
Fig 1D-E：随后作者分离了给予病毒5d的BALB/c 模型BA小鼠和对照小鼠的Gr-1+中性粒细胞，进行了单细胞测序。得到的细胞分为了两个群（K2-C1和K2-C2），K2-C1群的数量是K2-C2数量的3.2倍。E图显示70.9%的Gr-1+细胞表达CD177，而表达CD177的K2-C1占到了90.4%。提示CD177+细胞可能是Gr-1+细胞中的一个功能性亚群，而且是K2-C1的marker。F图显示组间比对的话，CD177+细胞占到对照组Gr-1+细胞的74.5%，造模后轻度下降到66.7%.
Fig 1G：小鼠造模后中性粒细胞出现很多干扰素相关基因的表达。
Fig 1H：功能富集也主要富集到干扰素反应和抗原呈递等通路。
Fig 1I：中性粒细胞脱颗粒相关基因也出现表达增加，可能参与胆道闭锁的形成。
2. Accumulation of CD177+ cells in patients with BA and a BA mouse model
Fig 2A, B：作者通过流式检测了正常对照、肝内胆汁淤结(IHC)和BA患者外周血和活检肝脏组织中CD177+细胞，发现BA患者外周血和肝脏CD177+细胞都显著升高。
Fig 2C：免疫组化结果提示，BA患者肝脏中增多的CD177+细胞主要位于portal areas。
Fig 2D, E：BA小鼠d3, 6, 9, 12肝脏中脾脏中的CD177+细胞都增高（虽然没有时间依赖性）
Fig 2F：免疫组化结果提示BA小鼠肝脏中的CD177+细胞主要位于periductal area。
Fig 2G：在NOD/SCID小鼠模型中，只有出现了黄疸的小鼠出现了CD177+细胞的增加。
3. Cd177 knockout alleviates the symptoms of RRV-induced BA in mice
为了进一步探究Cd177在BA中的功能，作者构建了Cd177-/-小鼠。
Fig 3A-D：所有给予了RRV诱导BA的WT小鼠都出现了黄疸，而Cd177-/-小鼠给予RRV后只有25%出现了黄疸，出现黄疸的时间也从6天延长到了9天。小鼠的体重减轻有所改善，死亡率也显著下降。
Fig 3E-H：和WT RRV小鼠相比，Cd177-/-RRV小鼠d6和d12时肝脏表面没有出现炎症和坏死灶；胆道造影显示没有闭锁；肝内胆道周围没有出现明显炎症；肝内胆道显示为较正常的管样结构。
Fig 3I：和正常对照相比，Cd177-/-RRV小鼠的各项实验室指标都较正常。
The results indicate that CD177+ cells play a major role in the pathogenesis of BA in mice.
4. Increased oxidative phosphorylation level in BA CD177+ cells isolated from the liver
为了探究BA和IHC患者肝脏CD177+的功能，作者分离了IHC (n = 41)和BA (n = 41)患者肝脏CD177+细胞，进行了Smart-Seq测序（不是单细胞，测的是bulk。而且只测了IHC和BA这两组，没有正常对照）
Fig 4A：展示了IHC和BA患者肝脏CD177+细胞的差异基因。和HC相比，BA患者的CD177+细胞出现了4,654个上调基因和2,590个下调基因。但是可以看到，组内异质性比较大。
Fig 4B：通路富集结果显示线粒体和中性粒细胞相关通路在BA患者的CD177+细胞中显著上调。
Fig 4C, D：上述通路中的重要功能性基因如DAP3, HSD17B1, MRPS34, SFN和线粒体特异性基因MT-ND3, MT-ND4, MT-CO1, MT-CYB显示出显著上调。
Fig 4E, F：中性粒细胞功能相关基因ELANE, FCRR2A, RHOA, VAMP8和氧化磷酸化/氧化应激相关基因CST3, CYBB (NOX2), IDH1和MPO也出现了上调。
The data presented here suggest a close relationship between enhanced mitochondrial activation and strong CD177+ cell immune function.
5. CD177+ cells of patients with BA promote BEC apoptosis via NETs
Fig 5A：为了探究是否BA患者的CD177+细胞可以引起胆道上皮细胞BEC的损伤，作者从患者外周血分离了CD177+细胞。
Fig 5B：Giemsa染色显示BA组的CD177+细胞缺乏分叶核并展示出增加的胞外细胞质的扩张。
Fig 5C, D：将con和BA患者的CD177+与胆道上皮细胞BEC共培养，结果显示和BA患者的CD177+共培养的BEC出现了死亡的增加。
Fig 5E：而且BA患者的CD177+诱导的BEC死亡主要是晚期凋亡而不是早期凋亡。
Fig 5F：随后作者检测了CD177细胞形成NETs的能力。不管是否加入PMA（phorbol myristate acetateNETs，NET activator）之后，BA组CD177细胞都可以生成NET filaments，而con组不管是否加入PMA都没有NET filaments形成。
Fig 5G-I：BA组培养细胞上清中的dsDNA, NE 和MPO也显著更高。
Fig 5J, K：作者使用了四种NETs抑制剂：NE inhibitor (sivelestat), PAD4 inhibitor (GSK484), ROS scavenger (N-acetylcysteine, NAC) 和DNase I来培养CD177细胞，并收取上清，用于条件培养基来培养BEC。结果显示BA CM培养的BEC和正常相比形态和细胞增殖都受损，细胞数量显著减少。给予不同Nets抑制剂后则都出现明显改善；PMA刺激组也得到了类似的效应 (Fig. S10A,B)。
Fig 5L：BA CM培养的BEC和正常相比出现了明显的死亡增加，给予不同Nets抑制剂后也同样都出现明显改善。
The results indicated that, in the context of BA, CD177+ cells could induce BEC apoptosis by releasing NETs.
6. Safety and efficacy of NAC in the treatment of BA
最后，作者想要去探究NETs抑制剂N-ace- tylcysteine (NAC)在BA患者中是否可以影响CD177细胞的数目和NETs形成。6例BA患者在Kasai procedure前接受了1周的NAC静脉注射（10例对照）。接受治疗后患者的general condition没有出现相关改变。
Fig 6A：作者分离了患者外周血，发现接受了NAC治疗的患者外周血CD177细胞出现明显下降。
Fig 6B：治疗后的胞内ROS水平也出现明显下降。
Fig 6C-E：线粒体活性、数量和NETs的形成在治疗后都出现下降。
Fig 6F：4例患者在Kasai术后额外给予了一周的NAC，结果提示治疗组总胆酸和直接胆红素和未治疗组 (n=56) 相比出现显著下降。
为了更好地理解潜在的信号通路，作者分离了BA (n=4) 和BA+NAC (n=6) 患者外周血的CD177细胞，进行了RNAseq。
Fig 6G：和未治疗组相比，治疗组的CD177细胞出现了4个上调和41个下调基因（好少哦）
Fig 6H：下调通路的Metascape分析显示主要富集到了中性粒细胞脱颗粒、MAPK信号通路的调节和白细胞迁移等通路。
Fig 6I：治疗后下调的基因包括了CEACAM1 和S100A12 (参与多种通路)、STOM 和 HK3 (参与中性粒细胞脱颗粒)、GADD45A (参与MAPK信号通路)。有趣的是，NAC治疗下调了CD177的表达并增加了RASA4基因的表达。
These data suggest that NAC can reduce the number and expression of CD177+ cells, probably through inhibition of neutrophil degranulation, suppress the formation of NETs and ameliorate the pathological conditions of BA.
这篇文章机制做的不深，但是思路很清晰，临床意义非常大。
1. 小鼠肝脏Gr-1+中性粒细胞的单细胞测序发现引起BA主要是CD177+中性粒（适应性免疫缺陷鼠也是一样）
2. CD177+中性粒在BA患者外周血和肝脏，小鼠肝脾中都出现明显增加。
3. Cd177敲除减轻了RRV诱导的BA
4. BA患者外周血CD177+中性粒的转录组测序探究了一下机制，发现氧化磷酸化增加。
5. 和BEC的共培养发现CD177+中性粒可以介导BEC损伤，而且这种作用主要由NETs介导(给抑制剂后损伤减轻)。
6. NETs抑制剂的临床使用，显示有效。
