科研人必备的实验技能

生信需要做湿实验吗？有人认为不需要，有人认为需要。做一个好的研究不仅需要大量的生信分析，还需要更多的实验验证，生信分析和实验结果往往是相互促进的。接下来，从生物实验的角度跟大家分享掌握湿实验必备的一些技能或技巧。

1. 基础知识储备

任何一个新的研究方向都离不开理论依据，查阅参考文献资料并总结是一个科研人的必备技能。启动实验的第一步当然就是实验模型的建立。

关于动物模型制作：在开始制作活体动物模型之前，查阅文献，确定制作方法，包括但不限于确定实验鼠类型、月龄、性别、给药剂量、给药方式、一次或多次给药时间、动物生存活动环境，实验鼠是否需要分笼单只饲养、给药前是否需禁水和（或）禁食等等，如果模型制作失败，请检查制作模型的过程中的每一个步骤，必要时再次查阅相关资料适当调整。

以小鼠灌胃给药为例，选用合适型号的灌胃针，抓取小鼠使其头颈部成一条直线，方便灌胃针从口角进入。针头进入小鼠的食管即可，不可过深，手法要轻柔，否则会戳伤小鼠食道或胃壁，灌胃容积一般不超过0.8毫升，最多不可超过1毫升。

2. 手术操作或取材

这一部分没什么需要特别注意的，记住两点：准备好取材所需器材，例如手术刀、组织剪、眼科剪、镊子、EP管、培养皿、75%酒精、麻醉剂和必备液体（例如4%PFA固定液）等；提前了解目标取材位置，要尽量快速地做固定、冷冻、离体孵育或其他处理，保证实验样本保存完好。

3. 明确实验目标的特征或特性

根据研究目标的不同水平选择实验类型，例如，在蛋白水平，一般选用特定染色方法显示形态或共存情况，选用Western Blot统计蛋白量表达的升高或降低；在RNA水平，一般选用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）体现基因表达的上调或下调等；在离体状态，可选用模拟体液环境的孵育实验对离子通道进行干预或不做干预，探讨研究目标的产生、分泌、消耗等；利用在体实验探讨生理或病理（口服给药，腹腔注射，静脉注射，基因敲除等）情况下研究目标的变化或调控等。如果不清楚如何选择实验方法，查阅文献资料或者问前辈。

以染色为例：选择典型的染色方法很重要。明场染色相较于免疫荧光染色保存时间较长。例如HE染色（观察组织形态等），PAS染色（糖原染色，一般用来显示糖元和其它多糖物质），DAB染色（免疫组化染色，需注意显色时间），Masson染色（胶原纤维呈蓝色，肌纤维呈红色。用来显示组织中纤维以及炎性因子的染色方法之一）等，一定要根据目标特性选择不同染色方法。

4. 准备实验材料

千万不要小看实验材料的准备，在选定实验方法之后，检查实验所用到的器械和材料等是否准备完毕，确保实验材料的齐全是保证实验顺利进行的第一步，毕竟在某些争分夺秒的时间里现场准备实验材料是来不及的，而且会大大影响实验结果的准确性。

注意一些实验常用液体（例如PBS，PBST，TBS，TBST，梯度酒精，Kerb’s液等），记得检查配液时间和可回收利用液体的使用次数等，如果发现肉眼可见的性状改变，如出现沉淀、絮状物，颜色改变等，请重新配液。

以Western Blot蛋白提取为例，样本类型不同（组织样本、贴壁细胞样本、悬浮细胞样本等）选择的裂解液也不同，要根据自己的实验目的选择合适的裂解液。一般使用RIPA裂解液（主要从动物组织和动物细胞中抽取可溶性蛋白）。RIPA裂解液的配方有很多种，根据其裂解液的强度大致可以分为强、中、弱三类。关于不同的RIPA裂解液以及其它裂解液的主要特点和差异，以及如何选择裂解液，参考如下：

另外，Western Blot蛋白转移膜也可根据实际情况选择。一般分为三种材质：NC膜，PDVF膜和尼龙膜，区别如下：

5. 把握实验时间

对于一些复杂的实验，请一定要根据实验步骤里规定的时间进行操作，不得提前或拖延。例如，染色过程中染色或脱色时间不准确，就会导致显色过深、过浅、深浅不一甚至不显色。再者，Western Blot电泳（俗称跑胶）时间一定不能提前结束或延迟结束，让蛋白跑得太久，指定离家出走，跑的时间太短又达不到分离蛋白的目的（可以根据溴酚蓝的位置判断跑胶时间是否合适，其实跑胶时间也不是特别固定的一个数字，而是一个区间，具体与蛋白样品、仪器电压、或凝胶的质量有关哦~ 当然，如果配胶过程出现问题，就可能导致胶体本身不凝，或漏液后凝胶量不够，导致配胶失败，这个在下一部分讲）；还有转膜过程，时间不合适的话，目标蛋白就跟你的NC膜或PVDF膜无缘啦！另外，注意合理安排自己实验的时间，注意一些总时长较久的实验，尽量早点开始做，否则要么饿肚子要么熬大夜，实验也不一定能做好，实惨。

6. 注意实验细节

切记“细节决定成败”。

以Western Blot胶体的配制为例，目前一般使用SDS-PAGE胶作为Western Blot的基础,按照说明书配液即可。在配制前的准本工作中，需注意仔细检查制胶器和玻璃板（包括长板和短板）是否完好，尽量避免玻璃板体存在较大的划痕或有角破损，充分洗净制胶器和玻璃板并晾干（可以喷洒无水乙醇加快水分蒸发），后进行胶体配制。这里分享一个配胶前的小技巧：组装好制胶器后，可以在玻璃板间隙加入一些无水乙醇，记住液面位置，计时3-5分钟，观察液面位置是否下移，判断该制胶器是否有漏液情况，否则在配胶过程中出现漏液情况是比较麻烦的，要拆了重洗哦~

胶体分为分离胶和浓缩胶（也就是通常说的下层胶和上层胶），胶体凝固的标志如下：

注意：此处分离胶上的酒精或DDW（deuteriumdepleted water）为隔绝氧气的作用（也有一部分压胶作用），必须要加，倒出后可倒置制胶器晾干或用滤纸从玻璃板间隙的一角吸干，要保证滤纸干净无杂质。图中将滤纸插入玻璃板间隙的做法个人不推荐，虽然不排除某些蛋白不受影响，但为了确保实验顺利，还是注意一些为宜。

分离胶凝固后加入浓缩胶，并立即插入梳子（对，它就叫梳子），插入梳子的过程中可以左右小幅度摆动梳子，避免浓缩胶中留有气泡。

浓缩胶凝固时间大约在40-60分钟，可观察到胶体与梳子分离，拔出梳子（或观察不到，但只要时间大概够了也可以拔出），注意要竖直向上拔出，避免左右摆动破坏凝胶，导致前功尽弃。

另外，如果Western Blot电泳时蛋白出现跑歪或条带相连的情况，可能的原因包括：（1）胶体均一度不好（一般是因为加入到玻璃板之前没有充分摇匀）；（2）胶体有气泡；（3）下层胶和上层胶的界面不平；（4）仪器的问题等。

下图为蛋白正常的样例，每一孔的蛋白各自待在自己的“跑道”位置，互不打扰：

但是如果发现根本没有条带，一定要去检查实验步骤是否有错误，去查阅文献，有可能你的目标蛋白在你的样本中根本不表达，或只有在特定条件下才表达。

关于蛋白样本提取：开始实验前问自己实验台面、液氮、器械准备好了吗？实验助手找好了吗？请尽可能快速剪碎组织，剪得尽可能碎，这样与裂解液充分接触（记得称重，根据样本重量确定加入裂解液体积），提取出来的样本才不会出现浓度过低的问题。样本数量较多时尽量要有小伙伴合作，否则第一个和最后一个样本相差时间太久，可能会导致提取效果不理想。如果只能自己提取样本的话，尽量不要一次性提取太多数量的样本，避免手忙脚乱哦。切记一定根据实验步骤实施。

关于免疫荧光染色：是以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术。孵育抗体时需要避光，注意阻水圈保持闭合，避免漏液；洗完切片尽量擦去阻水圈，注意不要碰到组织切片，否则可能前功尽弃。吸取封片甘油量根据组织切片大小适当调整，放盖玻片时注意不要留有气泡等等。封片完成之后请立即拍片，如果时间不允许，可避光4℃暂放（最好不超过24小时，如果存放2-3天的经历，拍出来的效果可能不尽人意），放太久荧光会逐渐淬灭的。

另外，免疫荧光染色一般可选择染1种（下图绿色UEA-1，DAPI染胞核不计入抗原种数）或2种抗原抗体结合物（绿色TIR和红色MUC2，黄色视为二者共存），也可染3种及以上，但是要根据激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laserscanning microscope）是否可以显示相应颜色来决定，一般染2种就可以了。

如果加入多于1种的抗体，那么请注意区分两种抗体的来源应与样本来源各不相同（例如，小鼠的结肠组织，不能使用小鼠来源的抗体，可以使用兔来源、驴来源或其他物种来源的抗体）。

7. 要有准备意识 做到心中有数

有些实验试剂需要现用现配，也就是说我们不能把所有材料都准备好再做实验，需要在实验间隙准备一些材料。那么作为实验新手，可能会出现下一步所需要的东西来不及准备的情况。这就需要我们在实验过程中有意识地去思考接下来的实验步骤，做到心中有数，才不会出现手忙脚乱的情况。

8. 注意科学性原则

无论哪一种实验，都应遵循实验的科学性，不可人为改变实验结果。当实验结果与实验假设不一致时，应遵循事物的客观规律。有些结果可能由于实验操作过程出现一些问题导致其本身就是错误的，应多次实验进行验证。当然，由于个体差异，某些实验数据会偏低或偏高，可以排除差异较大的个体，但是不可以纯粹为了验证假设，而有倾向地选取靠近假设的数据进行统计，这是违背科学性原则的。

9. 及时书写实验记录

很多时候实验结果不好的原因往往可以从实验记录中找到蛛丝马迹，但它却是经常被忽略的。实验记录的书写应该做到及时、真实、准确、完整地记录实验名称、实验目的、实验材料（包括实验试剂及配制方法、仪器、样本等）、实验过程和实验结果、出现的问题（应分析可能原因及解决办法）和实验小结（简要总结实验结果和解释，有助于指导后续研究）。每次实验还应该记录实验参与人、实验的日期和时间、以及实验条件（包括温度、湿度等）。因此一定要按时及时地书写实验记录，以便在实验过程中追溯实验原始数据并随时查阅。

10. 放平心态 保持乐观

做科研不是一簇而就的事情，不要期望只做一次实验就验证了假设或得到满意的结果。前期可能会出现各种各样的问题，这是通向科研本身的必经之路，没有捷径可言，而且要保证实验结果的可重复性，也必须多重复几次，夯实实验结论，最终的理论才更具说服力。保持一个乐观的心态做实验是我们一直需要修炼的技能，实验虐我千百遍，我待实验如初恋。当然，有些实验是就算重复N多次也不会有什么令人满意的结果的，因为可能一开始的方向就是错的。这就需要我们从知识储备开始，立论假设就要严谨、认真且全面，一定是阅读了大量参考文献和资料之后得出的研究方向和假设，要有立题依据，可以说查阅文献资料在整个做实验阶段是贯穿始终的。

各个实验都有或简单或复杂的步骤和技巧，但是核心原则和思想是相通的，以上分享的部分湿实验中所需要注意的一些细节和技巧，希望对生信分析过程中需要学习湿实验进行验证的小伙伴有所帮助。

(文中图片来自网络，侵删）

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