多角度探索已知癌症亚型的生物学意义，改善患者的生存

Clinical and biological relevance of the transcriptomic‐based prostate cancer metastasis subtypes MetA‐C

基于转录组学的前列腺癌转移亚型MetA-C的临床和生物学意义

发表期刊：Mol Oncol

发表日期：2021 Dec 10

影响因子：6.603

DOI:10.1002/1878-0261.13158

一、背景

        前列腺癌（PC）是男性最常见的恶性肿瘤，也是全世界癌症死亡的主要原因。致死性PC患者会出现骨转移性疾病，主要通过雄性激素剥夺疗法（ADT）进行治疗。在大多数情况下，ADT能减少转移瘤的生长，但最终会发展成转移性去势抗前列腺癌（mCRPC）。

        原发性PC及其转移表现出基因组的异质性，尤其是在mCRPC阶段，但大多数DNA改变的预后和治疗预测价值仍不清楚。对mCRPC患者转移样本的研究表明，RB1改变是预后不良的标志，也是唯一与雄性激素受体信号抑制剂（ARSI）治疗后生存不良相关的遗传标志。

二、材料与方法

1.数据来源

        1）来自67名骨转移性PC患者新鲜冷冻的转移组织样本，大多数（n=49）因转移性脊髓压迫接受了手术；分别从16例和2例患者获得髂嵴或淋巴结转移的核心活检。在采样时，患者要么是未发激素（n = 15），要么是去势抵抗（n = 42），要么是接受ADT治疗，时间较短，在1天至3个月之间（短期阉割，n = 10）。从一些患者中，从同一转移部位采集重复样本，要么在一个时间点（n = 14）或在不同的时间点，并在中间给予其他治疗（n = 6），该研究总共包括103个转移样本。

        2）该研究还包括分析先前发表的来自外部患者队列的RNA和全外显子组测序数据，这些数据是通过分析mCRPC患者不同器官的转移样本获得的，这里称为Quigley（n=101）和Abida（n=332）队列

        3）72个骨转移样本（GSE29650和GSE101607）

2.实验流程

        1）样品制备和微阵列分析

        2）转移亚型MetA-C的分类：通过对 72 个骨转移样本（GSE29650 和 GSE101607）的无监督聚类分析确定 MetA-C 亚型。确定了每个亚型的前 60 种差异基因产物，由 Mann-Whitney U 检验中的最低 P 值和将一个亚型与其他亚型分开的中值倍数变化≥ 1.5 定义。根据已有研究中分析的 PC 转移样本的转录本谱的主成分分析 (PCA)，从前 180 个 MetA-C 分化基因中，进一步选择了 157 个转录本作为一致的 MetA-C 相关联。

        3）差异表达和基因组富集分析：limma、基因组富集分析（GSEA）

        4）雄性激素受体活性、增殖和神经内分泌样分数：转移瘤样本的AR活性和增殖分数是通过PCA得到的第一主成分t1值，该值被预先定义为与典型AR活性和细胞周期活性（增殖）有关；单个NEPC的分数是通过预定义的NEPC相关基因转录水平的PCA得到的

        5）MetA-C分化基因畸变的DNA分析和建模

三、实验结果

01-前列腺癌转移灶的MetA-C亚型是异质性的

        使用CIBERSORT工具，根据157个预定义的MetA-C区分基因转录物的表达水平，对ClariomD阵列分析的每个转移样本的MetA-C含量进行估计。大多数转移瘤样本显示出异质性的MetA-C亚型（图1A）。MetA的肿瘤含量与MetB和MetC的肿瘤部分成反比（n=103），而MetB和MetC则没有显示明显的关系。从同一转移灶获得的重复样本显示MetA-C的估计分数高度一致，在进一步的分析中，患者由MetA-C估计平均值代表。在分析MetA、MetB和MetC与临床特征的关系时，有6名患者的转移样本是在两个不同的时间点收集的，并且在这期间对CRPC进行了治疗，他们被代表两次，共留下73个转移样本用于进一步分析。这73个转移样本显示MetA-C的分布为78%、11%和11%（图1B），当根据其主要的亚型分类时。

图1    MetA-C亚型与ClariomD阵列分析的转移样本的生物和临床特征的关系

02-MetB亚型富含去势耐受性转移，并与不良预后相关

        将CIBERSORT估计的转移亚型分布与患者以前的治疗进行比较。作者发现在CRPC中，与未使用激素的病例相比，MetB的估计比例显著偏高，而MetA的估计比例明显较低（图1c）。因此，主导MetB亚型的患者在ADT后的预后最差，中位生存时间只有1.6年，而MetA和MetC患者的中位生存时间分别为5.3和8.2年（图1D）。在Cox生存分析中，MetB亚型与ADT后癌症相关死亡的风险增加有关，而相反，MetA亚型与风险减少有关。MetB的部分提供了独立于MetA和现有临床变量的预后信息。

        转移样本中MetA亚型的估计比例与诊断时和转移采样时测量的患者血清PSA水平呈正相关，而MetB的比例与血清PSA水平呈负相关。MetA-C亚型与诊断时的Gleason评分、原发肿瘤治疗或患者年龄没有明显关系。MetC含量与转移样本中的肿瘤上皮细胞比例之间存在弱的反向关系。

        没有观察到转移亚型与以前用AR靶向疗法（比卡鲁胺、恩扎鲁胺、醋酸阿比特龙）或化疗治疗CRPC之间的关系。然而，与其他样本相比，接受过破骨细胞抑制剂（唑来膦酸或地诺单抗）治疗的患者的转移样本含有非常低的MetB成分。相比之下，唑来膦酸/地诺单抗治疗的转移瘤中，MetA部分的中值明显高于未治疗的转移瘤。

03-MetB亚型在肝转移中含量丰富，与外部患者队列中的预后不良有关

        在Quigley（n=99）和Abida（n=332）队列中，通过RNA测序对外部转移样本的MetA-C含量也进行了估计，并结合现有的临床数据进行了评估。Abida队列被进一步分为两个亚队列，基于用polyA（n=266）或捕获（n=208）文库测序的样本。所有三个队列给出的结果都与ClariomD队列的结果很一致。此外，它们提供了评估与转移部位有关的MetA-C亚型的转移含量的可能性。

        Quigley和Abida的转移显示了MetA-C的明显异质性（图2A）以及MetA和MetB以及MetA和MetC亚型之间的反向关系。当根据主导的转移内容进行分类时（图2B），与其他患者相比，MetB转移的患者显示出较差的预后，以mCRPC诊断后（Quigley队列）或一线ARSI治疗后（Abida队列）的总生存率表示（图2C）。有趣的是，所有三个队列都显示MetB亚型在肝转移中明显富集，MetA亚型在淋巴结转移中明显富集（图2D）。

图2    MetA-C亚型与RNA测序分析的不同患者群转移样本的生物和临床特征的关系

04-MetA-C亚型在肿瘤生物学方面显示出差异

        为了探索MetA-C亚型之间的生物学差异，根据每个样本的主要亚型，进行了GSEA。与MetB和MetC相比，MetA表型显示出高雄性激素反应、蛋白质分泌和脂肪生成（图3A），而MetB表型的特点是许多与细胞周期活动和DNA修复有关的标志（图3B）。与MetA和MetB相比，MetC表型明显显示出上皮向间质转化（EMT）、肌肉生成和血管生成的迹象，而许多与炎症反应有关的富集标志与MetB亚型共享（图3C）。

图3    MetA-C亚型中丰富的标志基因集

        为了进一步研究MetA-C亚型之间的重要生物学差异，作者根据预先定义的基因组的相对表达水平，对每个转移瘤样本的AR活性、增殖和NEPC样特征进行评分。对于ClariomD谱系的转移瘤，MetA的含量与AR活性评分明显相关，而与增殖和NEPC评分呈反相关。相比之下，MetB和MetC的估计值与转移的AR活性评分呈反比关系。MetB含量的增加与较高的增殖分数有关，而MetC含量的增加与增殖分数的减少和NEPC分数的增加。在Quigley和Abida队列中观察到转移样本的MetA-C含量与其相应的AR活性、增殖和NEPC样评分之间的类似关系。

05-MetA-C亚型与肿瘤基因组畸变的关系，以及它们的独立预后价值

        在Abida亚群中，ETS基因融合（主要是TMPRSS2-ERG）阳性的转移样本显示MetA含量明显高于阴性病例，而在Quigley队列中没有观察到MetA-C含量与ETS基因融合状态之间的明确联系。MetB亚型系统性地表现出CNV损失和包括RB1在内的13号染色体上21个基因转录物水平的相应减少（图4），而MetA和MetC亚型没有表现出一致的CNV。根据相应的转录水平，用OPLS-DA进一步分析MetB相关的CNVs，以模拟其对样本亚型的影响（图4）。总体而言，在所有三个队列中，ITM2B的低表达水平与MetB亚型密切相关。在Abida队列中，与21个CNV损失相对应的其他转录物水平的降低对MetB亚型显示出明显的影响，包括RB1（图4B-C）。在Quigley和Abida队列中，不同的SNVs与MetA-C亚型相关，但只有RB1始终与MetB相关。总的来说，在Quigley和Abida的数据中，分别有63%和18-31%的以MetB亚型为主的转移瘤观察到RB1的畸变（有害的SNVs和/或CNV丢失）。

图4    根据显示CNV缺失和表达减少之间系统关联的基因的转录水平，对MetB亚型的肿瘤部分进行建模

四、结论

        根据不同的转录组图谱，PC转移瘤可以被区分为临床相关的亚型。MetA-C亚型在AR靶向治疗后显示出不同的生物学特性、器官倾向性和预后。MetA-C的表型、遗传和表观遗传特征表明，对转移性PC的多样化治疗方法要根据亚型进行测试。该研究的回顾性设计限制了对结果的解释，MetA-C亚型的治疗预测价值需要在前瞻性的环境中进行评估。此外，应制定MetA-C亚型的特异性治疗策略，主要是为了改善MetB患者的生存。

图 5 基于转录组学的MetA-C亚型的临床和生物学特征

图5显示了由当前研究验证的特定亚型的临床和生物学特征。悬而未决的问题仍有待回答：（i）MetA-C亚型是否具有内在性并可追溯到原发性肿瘤？（ii）MetA-C亚型是可塑的，并受微环境差异或处理的影响？（iii）肿瘤MetA-C异质性是否反映了混合细胞克隆或具有中间亚型的细胞？（iv）MetA-C细胞如何与其环境中的其他细胞类型相互作用？