Cell 重磅！补齐基因编辑技术蓝图最后一块拼图，线粒体基因编辑

线粒体是细胞中的微小细胞器，作为能量产生工厂的同时，也含有一些独立的遗传物质DNA。由于它是能量代谢的重要细胞器，如果基因发生突变，会导致多种母系遗传病，包括与能量代谢和衰老相关的严重疾病。目前已知的线粒体致病突变有95种，其中绝大多数为点突变。平均每5000个人里，就有一个人患上线粒体点突变导致的遗传病。致病点突变包含9种A-G突变和39种C-T突变。

虽然基因编辑在细胞的核基因组编辑上基本是成功的，但在编辑线粒体基因组DNA方面仍面临着巨大的挑战。目前运用成熟的CRISPR-Cas系统，由于引导RNA（gRNA）本身无法进入细胞器，因此不适用于编辑线粒体基因组中的这些突变。先前，有研究者以TALENs技术为基础，结合双链DNA脱氨酶DddA，开发出了可以在线粒体基因组中实现C-T单碱基编辑的新工具DdCBE，但是无法对A-G碱基进行编辑。

4月25日，韩国基础科学研究所基因组工程中心（Center for Genome Engineering, Institute for Basic Science）的研究人员在国际顶级期刊《Cell》上发表了一篇题为“Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”的报道。该研究揭示了一项新型的碱基编辑器，它能够实现在线粒体中精确进行A到G的碱基转换，名为转录激活因子样效应物相关脱氢酶（TALED）。这一发现可以被认为是基因编辑技术蓝图中的最后一块拼图。

线粒体基因组DNA（mtDNA）靶向碱基编辑是治疗这些线粒体遗传疾病以及在细胞系和动物中生产疾病模型的一种很有前途的方法，但由于缺乏适当的工具和方法而受到阻碍。工程核酸酶，包括锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活物样效应核酸酶(TALENs)，可以被设计成选择性地切割突变的mtDNA，从而降低野生型和突变的mtDNA分子混合物中的mtDNA水平(又称异质性)，但不能用于纠正同质突变或诱导mtDNA中的新生突变。

人类mtDNA中靶向A-to-G转换的碱基编辑器可以纠正这90个致病突变中的39个，包括引起Leber遗传性视神经病变(LHON)、线粒体脑病、乳酸酸中毒、卒中样发作(MELAS)和Leigh综合征的突变。在本研究中，研究者提出了可编程的TALE连接脱氨酶，由定制设计的TALE蛋白、分裂或催化缺陷的DddA变体和工程化的腺嘌呤脱氨酶组成，该酶催化腺嘌呤的水解脱氨作用产生肌苷，在复制过程中与胞嘧啶配对，从而用于人类mtDNA中从A:T 碱基对到G:C对的目标转换。

TALED主要由3种功能不同的成分构成。第一个成分是转录激活因子样效应物 (TALE)，是一种DNA结合蛋白，能够靶向特异的DNA序列，TALE通过线粒体定位信号进入线粒体后能够与特定的线粒体DNA序列结合。第二个成分是TadA8e，一种促进A到G转换的腺嘌呤脱氨酶，实现mtDNA中A-G碱基的转换。第三个成分DddAtox是一种胞嘧啶脱氨酶，它使mtDNA更容易被TadA8e编辑。

TALE融合腺嘌呤脱氨酶诱导mtDNA中的A-to-G编辑

TALE蛋白被设计为与人类线粒体中的ND1或ND4基因（一种脱氧腺苷脱氨酶变体）结合，称为TadA8e。它由大肠杆菌TadA工程改造而成。有针对性的深度测序表明，融合蛋白的活性很差，在TALE结合位点附近诱导A到G转换，频率范围为0.7%到1.2%。该结果表明尽管已知TadA变体作用于单链DNA (ssDNA)而不是双链DNA (dsDNA)，但当与与靶DNA结合的TALE蛋白融合时，它可以催化dsDNA中的腺嘌呤脱氨。

TALE脱氨酶可同时进行 A-to-G 和 C-to-T编辑

随后，研究者通过将TadA变体与预先表征的含有DddAtox的DdCBE融合来提高TALE相关脱氨酶的编辑效率。DddAtox是一种负责细菌间毒素DddA中胞嘧啶脱氨的酶部分。结果表明通过将TadA变体融合到DddAtox而产生的复合TALE脱氨酶可以在人类mtDNA中同时诱导A-to-G和C-to-T编辑。

TALE脱氨酶催化A-to-G但不催化C-to-T转换

接下来，研究者试图创建不同类型的碱基编辑器，这些碱基编辑器将只催化A到G的转换，而不会在mtDNA中进行C到T的转换。研究者推断，在任何一个亚基中都没有UGI的复合TALE脱氨酶对将避免C到T的替换，同时保留A到G的编辑活性。与TALE蛋白和分裂的DddAtox系统融合的TadA衍生的脱氧腺苷脱氨酶可以使dsDNA中的腺嘌呤脱氨基，从而有效地催化人线粒体中的A到G取代。

TAILED介导的mtDNA编辑对线粒体功能的影响

通过对细胞活力和耗氧率的检测发现TALED介导的mtDNA编辑没有细胞毒性，不会导致mtDNA不稳定或功能障碍。

TALED的脱靶编辑

研究者还进行了全线粒体基因组测序，以分析TALED与DdCBE的各种形式（分裂、单体和二聚体）的脱靶活动。结果表明，使用TALE脱氨酶融合蛋白可以在很大程度上避免由无TALE脱氨酶引起的脱靶编辑。

此外，TALED诱导的mtDNA编辑在单细胞衍生的克隆中被保留。细胞中的TALED表达是可以耐受的，允许分离单细胞衍生的突变克隆，并且mtDNA编辑在转染TALED的细胞群中分布不均匀。TALED诱导的RNR2位点突变引起氯霉素耐药，并且mtDNA中的同质突变可以通过药物选择获得。

总而言之，在短期内，TALED将有助于在细胞系和动物中产生mtDNA突变以创建疾病模型，这是药物开发的重要步骤。从长远来看，具有更高效率和特异性的TALED可以为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者中致病的mtDNA突变铺平道路，预示着线粒体基因治疗的新时代。此外，正如最 DdCBEs所示，编码植物中数百个基因的叶绿体DNA（其中许多基因对光合作用至关重要）可以用植物兼容的TALED进行编辑，从而开启植物遗传学和生物技术的新篇章。