(eccDNA)circle-seq讲座视频学习
系列笔记基于达澈生物讲座视频，从中初步学习了解生信分析中常遇到的组学分析技术。
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1、关于eccDNA
1.1 概念
- extrachromosomal circular DNA 染色体外环状DNA
-
指在真核生物中，指从正常基因组中分离或脱落下来（细胞核内），在染色体之外独立成环，以特殊的方式参与生理或病理过程。
image from 达澈生物
如上图左边是原核生物细菌示意图，也存在质粒环状DNA
-
下图为荧光观察示意图。以二号染色体为例，白色箭头即表示从2号染色体脱落下来的double minute双微小体(eccDNA的一种)
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1.2 分类
- from 50 base pairs to several mega-base pairs in length；
即eccDNA长度分布范围很大 - Various types of eccDNA including small polydispersed DNA (spcDNA), telomeric cirlces, microDNA, etc. have been discovered.
- Among these eccDNA, extrachromosomal DNA (ecDNA), which encompasses the full spectrum of large, gene-containing extrachromosomal particles, has regained great research interest due to recent technological advances such as next-generation sequencing and super-resolution microscopy.
ecDNA作为eccDNA的一种，长度相对较大。因而就有可能有更多的序列信息，是研究的热点。
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1.3 目前研究
（1）结构特点
- 染色体外，环型
- 可包含染色体多个位置的不同序列
- 可携带完整基因及其上有启动子、增强子元件
- 染色质开放性程度更高
- 活化性组蛋白修饰（H3K27ac等程度更高）
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（2）相关功能
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- 能提高癌基因、耐药基因等拷贝数和转录水平；
前期研究表明肿瘤细胞有较多的eccDNA分布 - 随机分配到子细胞、驱动肿瘤的异质性
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- 介导DNA超远距离的相互作用
- .......
2、eccDNA研究方法
2.1 光学、荧光等技术
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我认为主要是用于观察、验证eccDNA的存在与否
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-
实验中的一个细节就是捕捉处于有丝分裂中期metaphse阶段的细胞，用于观察
因为此时为染色体 Chromosome状态， Chromosomes is rolled up DNA when it is going through cell division. Sister chromatids are the branches of the same chromosome.即染色体结构致密、凝集，ecDNA结构便于发现
而非分裂期的染色质 Chromatin 状态则相对十分松散，难以观察到那些小DNA环
image
2.2 测序分析
- 目前有两种路线，一种是进行全基因组测序WGS，从中筛选eccDNA结果；主要会用到
AmpliconArchitect软件。不多做介绍，重点了解下第二种方法
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- 另一种则是直接提取制备circle DNA 文库，进行测序；即circle-seq
（1）上游实验流程
- 提取全基因组；
- 去除线性DNA（5-7d）
- 环状DNA扩增
- 建库测序
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（2）read比对
-
由于环状DNA的特殊性，read pairs情况有点复杂。需要记住的一点是eccDNA是由一段线性DNA环化而成，也就是说环上有一个连接点（circle conjunction）
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- 如上图，主要有三种read pairs
regular read pair（方向相对）
discordant read pair（完全跨junction，方向相反）
split read（一端在junction） -
对此，可用circle-map软件进行识别比对。原理见下图
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（3）后续分析
-
read比对后，可注释环状DNA的序列功能区信息等等
image from 达澈生物
- 以上是一般都会做的标准流程分析，之后可根据自己的目的，联合多组学等方法进行深入探索。这些可以阅读相关文献，推荐如下。
- Molecular Size and Circularity of DNA in Cells of Mammals and Higher Plants. Proc Natl Acad Sci US A, 1965
- Extrachromosomal microDNAs and chromosomal microdeletions in normal tissues. Science, 2012
- Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA. Science, 2014.
- Extrachromosomal oncogene amplification drives tumour evolution and genetic heterogeneity. Nature, 2017
- New discoveries of extrachromosomal circles of DNA in normal and tumor cells. Trends Genet. 2018
- Circular DNA elements of chromosomal origin are common in healthy human somatic tissue. Nat Commun, 2018
- Extrachromosomal oncogene amplification in tumour pathogenesis and evolution. Nat Rev Cancer, 2019
- Functional Enhancers Shape Extrachromosomal Oncogene Amplifications. Cell, 2019
- Circular ecDNA promotes accessible chromatin and high oncogene expression. Nature, 2019
