【专利孵化项目库】一种miRNA的组合制备抗非小细胞肺癌药物中的
产品介绍
成纤维细胞是人的组织和肿瘤的关键细胞成分，可以分为静息和活化的成纤维细胞。例如，所述成纤维细胞在伤口愈合部位能被高度的激活。活化的成纤维细胞侵入病变部位并产生细胞外基质(Extracellularmatrixc,ECM)，充当一个其他细胞的支架。一旦伤口修复，活化的成纤维细胞恢复到静息的表型，这被称为正常成纤维细胞(NormalFibroblasts,NFs)。目前认为：肿瘤的发展不仅仅是由恶性癌细胞决定，也需要通过活化的肿瘤成纤维细胞或肿瘤相关成纤维细胞(Carci-noma-associated-fibroblast,CAFs)的参与。正常成纤维细胞(NormalFibroblasts,NFs)与肿瘤相关成纤维细胞(Carci-noma-associated-fibroblast,CAFs)在形态学上差异不大，但是功能上确相差迥异，肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)可以通过分泌多种细胞因子，趋化因子和细胞外基质促进肿瘤细胞增殖和进展。生长因子，例如，血管内皮生长因子(VEGF)，转化生长因子(TGF)和成纤维细胞生长因子2(FGF2)，都具有促进肿瘤细胞长生的功能，而正常成纤维细胞(NormalFibroblastsNFs)确没有以上功能。因此如果能找到一种促进肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)向正常成纤维细胞(NormalFibroblastsNFs)转化的方法，则可以使肿瘤细胞失去生长需要的各类细胞因子的支持，从而从另一途径起到抗肿瘤的作用。目前无论是抗肿瘤药物还是抗肿瘤治疗的方法多数是针对肿瘤细胞本身的，而针对肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的治疗药物和方法基本是空白。本发明将从通过一种新的方法促进肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)向正常成纤维细胞(NormalFibroblastsNFs)转化从而在非小细胞肺癌中起到抗肿瘤的作用。
微RNA(miRNA)是一类小的非编码RNA，在各种生理和病理过程中发挥重要的调节作用。越来越多的证据表明miRNA的不仅在癌细胞形成中过程中发挥作用，而且在成纤维细胞的转化及活化中起到调节作用。例如，miR-31，miR-214和miR-155重编程会促进卵巢癌的NF向CAF的转化。上调胃癌的CAF中miR-106b的表达水平可以促进胃癌细胞迁移和侵袭。miR-21被发现在大肠癌的CAF显著上调而后者有助于促进大肠癌的生长和侵袭。然而，在肺癌中，miRNA如何参与正常成纤维细胞(NFs)向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)的转化仍然不清楚。
根据世界卫生组织(WHO)公布的资料显示，肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，列男性常见恶性肿瘤的第一位，列女性常见恶性肿瘤的第2、3位。非小细胞肺癌占所有肺癌的80％,三分之二以上的肺癌患者在诊断时已发生转移，往往失去手术机会，而针对肺癌的化疗药物效果亦欠佳，患者容易产生耐药，五年生存率低于5％，亟需寻找新的、有效的治疗肺癌的方法。以往研究往往集中于抗肿瘤细胞本身，越来越多的研究发现，肿瘤微环境在肿瘤形成是也发挥重要的作用。发明人发现通过改变miR-1,miR-206和miR-31的表达水平可以促进促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化，同样可以起到抗肿瘤的作用。这种新方法的制备在治疗非小细胞肺癌方面具有很好应用前景。
本发明属于基因工程领域，特别涉及通过改变一组miRNA的表达水平促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化。这一组miRNA全新的组合是：miR-1,miR-206和miR-31。通过在肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞中同时过表达miR-1/miR-206,低表达miR-31可以促进其向正常成纤维细胞的转化，从而在细胞和动物水平起到抗肿瘤的作用，具有潜在的抗肿瘤应用价值。
专利技术
一般性说明：
实施例中末注明具体条件的的实验方法，基本上都按照Sambrook，J等人编著的《分子克隆实验指南(第3版)》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,3rded.黄培堂等译，科学出版社.2002.8)中所述的条件及方法或按照材料提供商所建议的条件及方法进行，其它没有详细描述的技术相应于本领域人员来说是熟知的标准方法。
本发明的材料：本申请中提及的细胞株、脂质体以及培养基均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具和生物材料来代替。
pre-miR-1的制备方法：1.pre-miR-1序列(pUC57-Simple-pre-miR-1)由南京凯基生物科技发展有限公司合成。目的载体pYr-mir30-shRNA-2购自长沙赢润生物技术有限公司；2.将pre-miR-1片段克隆至pYr-mir30-shRNA-2载体上；3.将克隆进行测序确认；4.质粒提取。
pre-miR-206的制备方法同pre-miR-1。
anti-miR-31是通过人工合成的miR-31阻遏物，起到抑制内源性成熟miR-31表达的效应)，利用lipofecmine-2000(购自invitrogen公司)将pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31共同转染入A549和H460细胞中，起到同时上调miR-1,miR-206和下调miR31表达的作用。
实施例1
一.非小细胞肺癌肿瘤相关成纤维细胞与正常成纤维细胞中miRNA的差异表达
(一)：基因芯片检测3例非小细胞肺癌患者肿瘤相关成纤维细胞(CAF)及配对的正常成纤维细胞(NF)中miRNA表达水平；
1.芯片制备及分析:按照美国的LCSciences公司的要求准备肺癌细胞标本，交由LCSciences公司进行芯片制备，SangermiRBaseV10.0版本完成芯片分析。
2.芯片结果:实验数据来自LCSciences公司，结果如图1所示。
3.结果分析:与NF相比较，CAF中miR-1/miR-206的下调最为明显；miR-31的上调最为明显。
(二)：qRT-PCR分析15对非小细胞肺癌患者肿瘤相关成纤维细胞(CAF)及配对的正常成纤维细胞(NF)中miR-1,miR-206和miR-31的表达水平
1.方法：Trizol试剂提取细胞总RNA，qRT-PCR运用Ambion公司SuperTaq聚合酶系统和mirVana检测盒，人U6作为内参。
2.qRT-PCR结果：如图2所示。
3.结果分析：与NF相比较，CAF中miR-1/miR-206的下调比例达86.7％；miR-31的上调比例达93.3％；与基因芯片结果一致。
二.pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31共转染入A549，H460
miRNA质粒及抑制剂的共转染：pre-miR-1,pre-miR-206(购自invitrogen公司)和anti-miR-31(购自invitrogen公司)分别转染入A549，H460细胞株(购自中科院肿瘤研究所)中。具体转染方法如下：转染前一天，每孔接种3×105个细胞到六孔细胞培养板中，每孔中加入不含抗生素的1640培养基(购自invitrogen公司)，使转染时的细胞密度达到30％-50％；
1)制备pre-miR-1,pre-miR-206-lipofecmine2000混合液、anti-miR-31-lipofecmine2000混合液：
a.对于每个转染样品，按以下步骤准备：用250ul1640培养基分别稀释100pmol的pre-miR-1,pre-miR-206、anti-miR-31，轻轻混匀，室温孵育5min；
b.稀释lipo2000：用245ul1640培养基稀释5ullipofecmine2000(购自invitrogen公司)，轻轻混匀，并室温孵育5min；
c.将a与b轻轻混匀，室温孵育20min，获得pre-miR-1,pre-miR-206-lipofecmine2000混合液、anti-miR-31-lipofecmine2000混合液。
2)将pre-miR-1,pre-miR-206-lipofecmine2000混合液、anti-miR-31-lipofecmine2000混合液加入含有细胞的1500ul的培养孔中，轻轻混匀；
3)培养6h后，将孔中含pre-miR-1,pre-miR-206-lipo2000混合液、anti-miR-31-lipo2000混合液的1640培养基移去，更换新鲜1640培养基；
4)将培养板置于37℃的CO2培养箱中培养，获得转染细胞株。
三.分析共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中对A549及H460细胞细胞侵袭和转移能力影响
(一)方法：Transwell实验检测肺癌细胞与CAF或者CAF+pre-miR-1、pre-miR-206、anti-miR-31细胞共培养后转移能力的变化
(a)将无血清培养液与Matrigel胶以4：1比例混匀；
(b)取25μl上述混合液加入小室上室，操作轻柔。(c)37℃孵育2小时；
(d)取出小室，加入100μl无血清RPMI-1640培养液，37℃水化30分钟
(e)转染后的细胞消化重悬于培养液中
(f)在准备好的Transwell小室中加200μl含2％胎牛血清的RPMI-1640培养液及1x105个细胞，相对应的24孔板中加入600μl完全培养液；
(g)培养48小时；
(h)将小室取出后以PBS洗涤两遍，95％乙醇固定15分钟；
(i)结晶紫染色30分钟；
(j)PBS洗涤2遍，用棉签轻柔擦除Transwell小室内部细胞；
(k)显微镜随机计数5个不同视野细胞数，取平均数。
(二)结果测定：见图3，其中图中Scr为阴性对照组，pre-miR-1(图中per-1),pre-miR-206(图per-206)和anti-miR-31(图中anti-31)共转染到CAF后，与A549细胞和H460细胞共培养后，显著地降低其侵袭和迁移能力。
(三)结果分析：共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中，可以促进其向正常成纤维细胞(NF)的转化：即转染后的细胞通过与肺癌细胞共培养后可显著的抑制肺癌细胞侵袭和转移能力。
四.分析共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中对A549及H460细胞克隆形成能力的影响
(一)方法：
(a)取对数生长期细胞，用0.25％胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，作活细胞计数，用含10％胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度至1×106细胞/mL。然后根据实验要求作梯度倍数稀释；
(b)用蒸馏水分别制备出1％和0.5％两个浓度的低溶点琼脂糖液，高压灭菌后，维持在40℃中不会凝固。按1:1比例使1％的琼脂糖和2×DMEM培养基(含有2×抗生素和20％的小牛血清)混合后，取3mL混合液注入直径6cm平皿中(10cm平皿加7～10mL)，冷却凝固，可作底层琼脂置CO2温箱中备用；
(c)按1:1比例让0.5％的琼脂糖和2×DMEM培养基在无菌试管中相混以后，再向管中加入0.2mL的细胞悬液，充分混匀，注入铺有1％琼脂糖底层平皿中，遂形成双琼脂层；
(d)待上层琼脂凝固后，置入37℃5％CO2温箱中培养10～14天。把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞克隆数。计算形成率。
(二)结果测定：图4。其中图中Scr为阴性对照组，pre-miR-1(图中per-1),pre-miR-206(图per-206)和anti-miR-31(图中anti-31)共转染到CAF后，与A549细胞和H460细胞共培养后，显著地降低其癌细胞克隆。
(三)结果分析：共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中，可以促进其向正常成纤维细胞(NF)的转化：即转染后的细胞通过与肺癌细胞共培养后可显著的抑制肺癌细胞克隆形成能力。
五.动物实验比较肺癌细胞与CAF或者CAF+pre-miR-1、pre-miR-206、anti-miR-31细胞共培养后裸鼠移植瘤的生长变化
(一)方法：(1)4-5周龄裸鼠随机分3组分别种植：A549,A549+CAFs和A549+CAFs-TM(CAFs-TM表示：共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAFs))。(2)消化以上的细胞并计数，将3×106个细胞用无血清RPMIDMEM培养基稀释至150μl，注射到裸鼠两侧皮下后背处。(3)肿瘤体积测量：裸鼠皮下肿瘤可见开始测量肿瘤体积，每两天测量一次，肿瘤体积计算公式：体积＝0.5×长×宽2。28天后将肿瘤从裸鼠身体剥离并称重，冻存于液氮管用于提取蛋白或RNA做相关检测。(4)对裸鼠处死的肺进行检测并进行HE染色，计算各种的转移指数。转移指数＝肺转移数量/原发肿瘤重量；
(二)结果测定：图5，图6，图7；与单独种植A549细胞相比，种植CAFs与A549细胞共培养后的细胞的生长和转移能力均能显著的提高。在CAFs中共转染pre-miR-1，pre-miR-206和anti-miR-31(图中CAFs-TM)则可以抑制肿瘤的生长与转移。
(三)结果分析：共转染pre-miR-1,pre-miR-206和anti-miR-31到肿瘤相关成纤维细胞(CAF)中，可以促进其向正常成纤维细胞(NF)的转化，从而可以在动物水平抑制肺癌的生长和转移。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>江苏省人民医院
<120>一种miRNA的组合制备抗抗肿瘤药物中的应用
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>71
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
ugggaaacauacuucuuuauaugcccauauggaccugcuaagcuauggaauguaaagaag60
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<210>2
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gctatgccagcatcttgcc19
专利优势
1、通过改变一组miRNA的表达水平促进肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞的转化。这一组miRNA全新的组合是：miR-1,miR-206和miR-31。通过在肺非小细胞肺癌的肿瘤相关成纤维细胞中同时过表达miR-1/miR-206,低表达miR-31可以促进其向正常成纤维细胞的转化，从而在细胞和动物水平起到抗肿瘤的作用，具有潜在的抗非小细胞肺癌的应用价值。
2、目前较为常用的抗肿瘤治疗均针对于肿瘤细胞本身，本发明通过促进肿瘤成纤维细胞的正常化起到抗肿瘤的作用，是治疗肿瘤的新方法。
产品样图
图1
图2
图3
图4
应用科室或临床需求
适用于肿瘤科中，涉及非小细胞肺癌肿瘤相关成纤维细胞向正常成纤维细胞转化方法的构建以及在抗肿瘤治疗中的应用。
商业价值评估
本专利经27家医院，共34名评估专家对其进行了临床价值评估，认为该专利具有较好的临床应用价值，具有一定程度的技术创新和技术壁垒，当前市场存在的竞品数量较少，竞争优势明显，因此预期将会有较好的市场机会和市场前景。依据市场可接受的价格和保守的市场份额估计，建议市场零售价1000~10000元，因此该产品预期盈利能力较好。厂家操作好该产品需要依靠成熟的渠道能力以及对该产品进行更好的价值挖掘，更详细多维度的临床价值评估报告可以在确定合作后,由江苏省转化医学研究院第三方评价中心提供。
专利保护及设计
该专利已授权，保护效果切实有效，我们也可以根据你的需求进行专利攻防，全面确保产品不被仿制。
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