FastQC数据质控报告的详细解读

1. Basic Statistics 基本信息

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• Encoding: 测序平台编号，现在Sanger/ Illumina 1.8以上都是Phred 33编码

• Total sequences: reads数量（reads就是高通量测序平台产生的序列标签，翻译为读段！）

• Sequence length: 测序长度

• %GC: GC含量： 需要重点关注，可以帮助区别物种，人类细胞42%左右

2. Per base sequence quility：每个测序read各碱基质量【十分重要！】

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• 横轴：测序序列的1-251个碱基；

• 纵轴：质量得分，score = -10 * log10（error），例如错误率error为1%，那么算出的score就是20

• 箱线图boxplot：对每一个碱基的质量的统计。箱子上面的须（up bar）为90%分位数，下面的须（down bar）为10%分位数，箱子中的红线为中位数即50%分位数，箱子顶（upside）为75%分位数，箱子低（downside）为25%分位数。这个boxplot的意义：一是看数据是否具有对称性；二是看数据分布差异，这里主要利用了第二点。bar的跨度越大，说明数据越不稳定。

• 蓝色的线将各个碱基的质量平均值连接起来

• 解释一下：图中蓝线的走势为何先高后低？因为目前采用的边合成边测序使用的是化学方法促使链由5'向3'延伸，也就是利用了DNA聚合酶。刚开始测序，合成反应还不是很稳定，但是酶的质量还很好，所以会在高质量区域内有一定的波动（这里的1-30bp），后来稳定了，但是随着时间的推移，酶的活力逐渐下降，特异性也变差，所以越往后出错几率越大。【就像一个司机开车，一开始小心谨慎，起步慢，开的也慢，慢慢提速。后来越开越带劲，但是也越来越困，疲劳驾驶容易出事】

• 一般能用的数据都要求至少Q20，也就是下四分位（10%分位数）的质量值要大于20。因此这里的189bp后面的需要切除，才能继续分析

• 二代测序，最好是达到Q20的碱基要在95%以上（最差不低于90%），Q30要求大于85%（最差也不要低于80%）

3. Per sequence quility scores：每条序列 质量统计

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• 横轴：质量值0-40，也即是Q值

• 纵轴：每个质量值对应的read数

• 我们的例子中一条read有251bp， 那么其中任意一条的251bp的质量平均值就是这条read的质量值。只要大部分都高于20说明比较正常

4. Per base sequence content：read各个位置碱基比例分布

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• 横轴：各碱基位置；纵轴：碱基百分比

• 四条线四种颜色代表四种碱基在每个位置的平均含量（一个位置会测很多reads，然后求一个平均）

• 一般来讲，A=T， C=G， 但是刚开始测序仪不稳定可能出现波动，这是正常的。一般不是波动特别大的，像这里cut掉前5bp就够了。另外如果A、T 或 C、G间出现偏差，只要在1%以内都是可以接受的

5. Per sequence GC content： 序列平均GC分布

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• 横轴为平均GC含量； 纵轴为每个GC含量对应的序列数量

• 蓝线为系统计算得到的理论分布；红线为测量值，二者越接近越好

• 这里不相符可能有两个原因：

1. 前面提到了，GC可以作为物种特异性根据，这里出现了其他的峰有可能混入了其他物种的DNA；

2. 目前二代测序基本都会有序列偏向性(所说的 bias)，也就是某些特定区域会被反复测序，以至于高于正常水平，变相说明测序过程不够随机。这种现象会对以后的变异检测以及CNV分析造成影响

• 如果出现怎么办？-- 把和我们使用物种GC-content有差异的reads拿出来做blast，来确认是否为某些杂菌

6. Per base N content： N含量分布

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• N是指仪器不能识别ATCG时给出的结果，一般不会出现。但是如果出现并且量还很大，应该就是测序系统或者试剂的问题

• 任意位置的N的比例超过5%，报"WARN"；任意位置的N的比例超过20%，报"FAIL"

7. Sequence length distribution： 序列长度统计

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• 理想情况下，测得的序列长度应该是相等的。实际上总有些偏差

• 当reads长度不一致时报"WARN"；当有长度为0的read时报“FAIL”

• 这里显示大部分都落在251bp这个测序长度上，有少量为250或252bp，但这不影响；如果偏差很大就不可信了

8. Sequence duplication level：统计序列完全一样的reads的频率

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• 横坐标是duplication的次数；纵坐标是duplicated reads的数目（红线）

• 解释下横坐标为何会有>10, >50等出现：测序的原始数据很大，如果每一条reads都统计，将耗时很久。这里软件只采用了数据的前200,000条reads统计其在全部数据中的重复数目,另外大于75bp的reads只取50bp进行比较。重复数大于10的reads被合并统计成了>10，以此类推...

• unique reads总数（蓝线）作为100%，上图中可以看出，大概仅有2%的uniqe reads可以观察到两次重复。也就是说，我们这里的非unique reads占总数比例仅有2%左右。

• 正常情况下的确，测序深度越高，越容易产生一定程度的duplication。高程度的duplication level，提示我们可能有bias的存在（如建库过程中的PCR duplication）。

  另外和做的项目也有关，一般转录组测序的结果中duplication level都比较高，60-70%都正常，这是因为转录组测的是基因的覆盖深度，各个基因表达量不同，如果某个基因覆盖度较高【tip：覆盖度是指基因/转录组测序测到的部分占整个组的比例】，那么测的部分就越多，相对应的duplication也会更高；对于外显子组测序来说，一般覆盖度比较一致，这里出现了duplication就不太正常。

• 当非unique的reads占总数的比例大于20%时，报"WARN"；当非unique的reads占总数的比例大于50%时，报"FAIL“

9. Overrepresented sequences：大量重复序列

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• 和第8个duplication计算一样，也是取前200,000进行统计，大于75bp只取50bp。

• 发现超过总reads数0.1%的reads时报”WARN“，当发现超过总reads数1%的reads时报”FAIL“

10. Adapter content: 接头含量

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• 表示序列中两端adapter的情况

• 软件内置了四种常用的测序接头序列， fastqc 有一个参数-a可以自定义接头序列

• 此图中使用的illumina universal adapter并未去除，后期再使用cutadapt去接头

11. （还有一类这里没体现）Kmer content： 重复短序列

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• 表示：在序列中某些特征的短序列重复出现的次数

• 这个图是转录组测序的一个文件，可以看到6-9bp几种短序列都出现了好多次。出现的原因可能是：

1. 没有去除软件内置的adapter或者没有使用-a参数自定义adapter

2. 序列本身重复度较高，例如在建库PCR过程出现序列偏向性bias--> 这在转录组测序中确实存在