刘小泽学习GSEA

刘小泽写于2020.1.22-23
自从上次写过豆豆在UM的第一天 就开始了适应过程，到现在也适应差不多了，一切步入正轨，赶在过年之前发一波
我们经常听说：Gene Set Enrichment Analysis、GSEA、基因集富集分析，这三种实际上都是描述的一种方法，就是寻找基因的功能大概是什么样子的。
这一次，就来认识一下GSEA吧

以往的认知

我们经常做转录组分析，于是最熟悉的是：差异分析 + 功能注释。经常设定一个logFC阈值，然后找变化倍数大于或者小于这个值的基因，作为上调或者下调。而这个阈值的设定，经常没有一个标准，主观性很大，但有时也会添加一点统计知识进去，比如利用mean + 2sd来计算这个阈值。

最后会利用这些差异基因，来进行GO或者KEGG的注释，找到它们主要在哪些通路富集，从而提供一些思路。

那么以上👆的思路就属于：过表征分析（ORA, Over-Representation Analysis），属于初步探索。

当然其中也会有一些问题，例如：

• 只分析差异基因，但表达真的只受那些变化大的基因影响吗？
• 我们设置的logFC靠谱吗？不同的logFC得到的差异基因数量不同，那么再进行富集分析的结果又有多少重合呢？
• 找差异基因的过程往往假设基因间是相互独立的，但实际上许多基因的关系还是很密切的
• 另外即使两个基因都被分在了上调基因组，一个FC是8，一个FC是4，那么能认为这两个基因的特征是一样的吗？
• 如果现在有两个实验组，都分别找到了差异基因，现在想通过找它们共同的差异基因，然后做富集分析。但是，结果可能是：两个组的差异基因数量本身很多，它们的交集很少（比如才二三十个），这样再向下做差异分析就很困难

之前也介绍过相关的内容，见：富集分析Enrich Me！ 、富集分析Enrich me again!

GSEA就是属于第二代方法：FCS(Functional Class Scoring)的范畴

基本上能看到类似的这种图就说明是用GSEA做的：

那么怎么认识这个GSEA呢？

毕竟之前和它大的交道少，于是需要大体了解一下（但不是说去钻研算法）

从原理开始

• 和差异分析类似，GSEA也是需要计算treat-control组的差异（比如log2FC），但是它先不设定阈值
• 然后从大到小对差异倍数排序，并且知道这个排序结果对应的基因名=》也就是得到了一个基因列表（L）
• 从计算方法就能得知，这个基因列表的一侧主要是treat的特征，另一侧主要是control的特征
• 之后，使用已经发布并且公认的基因集做检验，这个基因集主要是从MSigDb（分子标签数据库 http://software.broadinstitute.org/gsea/msigdb/index.jsp）获得，其中会包括GO、KEGG、Reactome等注释内容

其实排好序之后，我们可以手动去基因列表L的两侧去查，看看有没有我们想要的基因，但往往一个基因列表动辄上万，因此这个方法虽然可以做，但软件和统计知识并不允许我们去这么干。

于是，事先将已知的通路（包含相关的基因信息）存储起来，用的时候直接去验证它们就好了，而这个就是基因集富集分析的基因集。比如要看某个GO term在我们排序好的基因列表中富集在头部还是尾部，就能反证我们的基因集中treat组上调或者下调基因是否属于这个通路

GSEA方法的原假设是：某个通路的全部基因在我们排序后的基因列表中随机分布，如果我们看到它们”意外“出现在基因列表的某一端（从图上看是在某一侧形成一个峰），那么就可以计算显著性来看看富集程度如何。如果富集结果显著，那么就拒绝原假设，认为这个通路的基因在我们的基因列表中富集，并且看到富集分数

名词解释

• 富集分数：这个名词是个重点，划下来! 英文名称是：ES(Enrichment score)。当使用基因集的基因来遍历我们的基因列表时，就会判断基因集的基因是不是存在于基因列表。如果存在就加分，不存在就减分。但具体的分数计算规则看看这个图就好（https://bioinformatics.cancer.gov/sites/default/files/course_material/GSEA_Theory.pptx）。只要明白GSEA的那条曲曲折折的线就是通过不断的加分减分做出来的就行了。那些对ES值有贡献的基因称为 Leading Edge Subset

  

• 基因列表的排序规则：前面提到我们会对差异分析结果使用log2FC进行排序，当然这只是GSEA的排序规则中的一种。它的默认方法是：Signal to Noise Ratio。一般对于treat-control这种分组的样本，可以使用：Signal2Noise, t-test, Ratio of Classes 【也就是fold change】,log2_Ratio_of_Classes 【也就是log2FC】；另外，还有一种连续型的样本（例如时间序列样本），它们可以用：Pearson, Cosine, Manhattan, Euclidean方法【详细看：http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Metrics_for_Ranking】

参考资料

• Lecture 21: Gene Set Enrichment Analysis - Bioinformatics

GSEA怎么分析

方法一：R语言

首先也是做一个差异分析，可以用limma、edgeR或者DESeq2

然后需要一个基因列表，按照log2FC从大到小排序

# 得到差异分析结果：DEG_mtx
geneList <- DEG_mtx$log2FoldChange
# 如果是Ensemble ID，并且如果还带着版本号，需要去除版本号，再进行基因ID转换，得到Entrez ID
names(geneList) <-  str_split(rownames(DEG_mtx) ,
                              pattern = '\\.',simplify = T)[,1]
geneList_tr <- bitr(names(geneList), 
                        fromType = "ENSEMBL",
                        toType = c("ENTREZID","SYMBOL"),
                        OrgDb = org.Hs.eg.db) 

new_list <- data.frame(ENSEMBL=names(geneList), 
                           logFC = as.numeric(geneList)) 
new_list <- merge(new_list, geneList_tr, by  = "ENSEMBL")
geneList <- new_list$logFC 
names(geneList) <- geneList_tr$ENTREZID 
# 最后从大到小排序，得到一个字符串
geneList <- sort(geneList,decreasing = T) 

再利用clusterProfiler进行GSEA分析

• 如果进行GO分析

  # 想看biological process(BP)，可以先不过滤p值
  go_result <- gseGO(geneList     = geneList,
                     ont = "BP", 
                     OrgDb = org.Hs.eg.db,
                     minGSSize    = 10,
                         maxGSSize = 500,
                     pvalueCutoff = 1)
  # 将其中的基因名变成symbol ID
  go_result <- setReadable(go_result, OrgDb = org.Hs.eg.db)
  # 还可以直接点击查看，只需要转成数据框
  go_result_df <- as.data.frame(go_result)
  

  如果对结果的某个通路感兴趣，可以作图

  gseaplot2(go_result, geneSetID = c("GO:0006695"))
  

• 如果要进行KEGG分析

  kk <- gseKEGG(geneList     = geneList,
                          organism     = 'hsa',
                          nPerm        = 1000,
                          minGSSize    = 10,
                                    maxGSSize = 500,
                          pvalueCutoff = 1,
                          verbose      = FALSE)
  

  作图依然是：

  gseaplot(kk, geneSetID = "hsa04110")
  

方法二：GSEA软件

搞定输入

软件需要三个输入文件，分别是：

• 表达谱文件（.gct文件或者符合要求的.txt）。GSEA原来提供了RNA-seq原始数据的标准化、差异分析等一系列流程，也就是说提供原始count矩阵是可以的。但现在，官方建议先使用其他方法（例如Deseq、limma等）进行标准化后，再导入

  http://software.broadinstitute.org/cancer/software/gsea/wiki/index.php/Using_RNA-seq_Datasets_with_GSEA

• 样本信息文件（.cls）

  cat(c(4,2,1,"\n"),file = "test.cls",sep = " ",append = F)
  cat(c("#trt","control","\n"),file = "test.cls",sep = " ",append = T)
  cat(c(rep(c("trt","control"),each=2),"\n"),file = "test.cls",sep = " ",append = T)
  

  

• 基因集文件（.gmt），这个可以从https://software.broadinstitute.org/gsea/downloads.jsp#msigdb这里下载，也可以在软件中直接加载

  之前技能树写过：https://www.jianshu.com/p/b409a5576ce1
  其中结合芯片数据介绍了：批量运行GSEA，命令行版本；制作自己的gene set文件给gsea软件

调整参数

参考：http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#_Run_GSEA_Page

• Numbers of permutation：当分析多个基因集时，就要注意这个多重假设检验。就相当于多次抽样，次数越多越准确。这个默认是1000次。但建议先从小的数字开始尝试运行（例如10），先完成再完美

• Permutation type：这里有两个选择，一个是phenotype，一个是gene_set。第一个phenotype效果最好，官方建议如果每个组的样本都在7个以上，就使用phenotype；反之如果有一个组少于7个样本，那么就用gene_set【另外，在GSEA 4.0之前的版本，gene_set叫做tag permutation】

• Phenotype Labels：一般是设置treat vs control
  【参考：http://software.broadinstitute.org/gsea/doc/GSEAUserGuideTEXT.htm#Phenotypes】

查看结果

程序一般会在主目录下新建一个目录：gsea_home，然后 output 里面按照日期进行排序

里面的文件会非常多，但有一个总览index.html：

就会看到：

• 第一个结果是处理后上调基因倾向于富集的通路
• 第二个结果是处理后下调基因倾向于富集的通路

并且它们都可以直接点开看结果，或者将excel读取到R语言中进行处理

如果要把结果读取到R中

结果文件也是存放在了index.html同级目录中，就是一个excel表格

GSEA_result_up <- readr::read_delim("gsea_report_for_trt_9111157956735.xls",delim = "\t")
GSEA_result_up <- GSEA_result_up %>%
    select(NAME,NES,SIZE,`FDR q-val`)

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