NGS021 CRISPR靶向捕获测序

CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物基因组内的一段重复序列，在细菌和古生菌中，有规则间隔的簇状短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白（Cas）构成了对噬菌体和其他外源基因的适应性免疫系统。

CRISPR位点结构

CRISPR工作机制

CRISPR工作机制

近年来在理解CRISPR-Cas免疫三个阶段的潜在机制方面取得了重大进展：

• 第一阶段：外源性DNA获取
  在适应过程中，外来核酸被识别，加工并整合到CRISPR阵列中以提供感染记忆。
• 第二阶段：crRNA成熟
  当转录CRISPR阵列以产生长的前体crRNA（pre-crRNA）时，将检索内存，该序列在重复序列中进行处理以产生成熟的crRNA。
• 第三阶段：干扰
  在随后的感染中，干扰机制由crRNA引导，以切割外源核酸中的互补序列（称为原间隔子）

CRISPR分类

Class1 CRISPR/Cas系统
Class2 CRISPR/Cas系统

CRISPR-Cas系统是在原核生物中发现的适应性免疫系统，并基于效应蛋白组织(cas genes and the nature of the interference complex)被分为两个不同类别。第1类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物，而第2类CRISPR-Cas系统利用单蛋白效应物。基于不同的效应蛋白家族，第2类系统可分为三大类和九个亚型。其中Class2 CRISPR/Cas系统 Type II也即是目前应用最广泛，研究最深的CRISPR/Cas9系统

DNA损伤修复机制

DNA repair

来自微生物CRISPR适应性免疫系统的Cas9核酸酶通过其指导RNA（红色）上的指导序列定位到特定的DNA序列，直接与DNA靶碱基配对。DNA双链断裂（DSB）通常通过非同源末端连接（NHEJ）或同源直接修复（HDR）进行修复

IDT Alt-R CRISPR-Cas9系统

IDT Alt-R CRISPR-Cas9系统

• Ribonucleoprotein components
  Option 1: Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA:tracrRNA
  Option 2: Alt-R CRISPR-Cas9 sgRNA
  Alt-R S.p. Cas9 Nuclease/Nickase
• Additional reagents and kits
  Alt-R CRISPR-Cas9 Control Kits
  Alt-R CRISPR-Cas9 Electroporation Enhancer
  Alt-R HDR Enhancer
  Alt-R Genome Editing Detection Kit

Alt-R Cas9切口酶

• Wild type

  
  野生型Cas9
  

  双链断裂（DSB）
  源自化脓链球菌的WT Cas9蛋白包含两个内切核酸酶结构域（RuvC和HNH），它们通过切割双链DNA（dsDNA）的相对链一起发挥作用，以生成末端为平末端的dsDNA。
  -Mutant type

  
  突变型cas9
  单链切口
  使两个核酸内切酶结构域之一失活导致形成Cas9切口酶突变体，该突变体在目标dsDNA的一条链中引入了一个切口。
  

  RuvC突变体（Cas9 D10A）在靶向链（gRNA互补）上产生缺口
  HNH突变体（Cas9 H840A）在非靶向链（非互补gRNA）上产生缺口

Cas9靶向测序

工作流程

gRNA设计
RNP组装
Cas9剪切及分析
T7E1切割实验

T7 核酸内切酶 I 识别并切割不完全配对 DNA、十字型结构 DNA, Holliday结构或交叉DNA, 异源双链DNA或者以更慢的速度切割或切刻双链DNA。该酶切割错配碱基 5′ 端的第一、第二或第三个磷酸酸二酯键。

Application

Cas9 nanopore sequencing

Reference：Single-stranded Nicks Gilpatrick T, Lee I, Graham J E, et al. Targeted Nanopore Sequencing with Cas9 for studies of methylation, structural variants and mutations[J]. BioRxiv, 2019: 604173.