GUS染色方法

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GUS应用及原理

Gus基因存在于某些细菌体内，编码β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase，GUS），该酶是一种水解酶，能催化许多β-葡萄糖苷酯类物质的水解。因为绝大多数植物细胞内不存在内源的GUS活性，因此gus基因广泛用作转基因植物的报告基因，尤其是在研究外源基因瞬时表达的转化实验中广泛应有。此外，gus基因3’端与其他结构形式的融合基因也能够正常表达，所产生的融合蛋白仍具有GUS活性，这对研究外源基因表达的具体细胞部位提供了方便条件，也是它相对于其他报告基因的一个优点。 在适宜条件下，该酶可将X-Gluc水解生成蓝色物质，初始产物并不带颜色，为无色的吲哚衍生物，后经氧化二聚作用形成5,5’-二溴-4,4’-二氯靛蓝染料，此靛蓝染料使具有GUS活性的部位或位点呈现蓝色，可用肉眼或在显微镜下观察到。一般用来显示某基因的组织表达模式。

以上内容出自网页内容：http://www.real-times.com.cn/Technology/GUS.htm

GUS染液配制

我们使用的是翊圣公司的X-Gluc，下面的protocol也是翊圣公司的。

试剂（母液浓度）	体积（1 ml ）	终浓度
ddH2O	830 μl	-
1 M 磷酸钠（pH7.0）	100 μl	0.1 M
0.5 M EDTA, pH8.0	20 μl	10 mM
10% Triton X-100	10 μl	0.1 (v/v)
50 mM 铁氰化钾	20 μl	1 mM
0.1M X-Gluc(50 mg/ml ) in DMF	20 μl	2 mM

以上这些试剂除了EDTA，其他试剂配制比较简单。下面是这些试剂配制的具体方法：

• 1 M 磷酸钠

  需要称取磷酸氢二钠和磷酸二氢钠各6.659 g和1.778 g，加入25 ml 左右的ddH₂O，最后定容到30 ml ，基本上混合均匀完全溶解即可达到pH7.0左右，无需调pH。

  注意：两者混合后一开始可能无法全溶解，需要过个几分钟才可以溶解。

• 0.5 M EDTA

  我们用的就是Na盐，称取5.584 g，加入20 ml ddH₂O，此时看到的是白色沉淀，无法溶解（只有在pH8.0左右的时候，EDTA才能够完全溶解于水中），然后加入0.5 g片状NaOH，此时pH可能还没有到达8.0，然后用9 M的NaOH溶液进行缓慢pH调整，观察溶液是否澄清。澄清时测定pH，调整直到8.0，最后定容到30 ml 。

  当EDTA全部溶解的时候，pH值大概就在8.0左右。

• 10% Triton X-100

  取0.5 ml Triton X-100，加入到4.5 ml的ddH₂O中，使其充分溶解，但是因为是表面活性剂，可能会出现较多的泡沫，静置一段时间后，自然会消失。

• 50 mM K₃Fe(CN)₆

  称取0.165 g，加入8 ml的ddH₂O，溶解后定容至10 ml。最后溶液的颜色是淡黄色的。

  三价铁容易被还原，因此需要将其避光保存，一旦发现颜色发生了变化，那么就需要重新配制。

• 50 mg/ml X-Gluc

  1 ml DMF溶解50 mg的X-Gluc粉末，浓度就是50 mg/ml。一般都是现配现用，需要多少用多少。一个样品染色，需要500 μl。根据样品的多少来称取粉末的量，不要太浪费。

染色

取上一步配制好的GUS染液，将你的样品加入其中，然后用锡箔纸包起来，放置于37℃，12h-16h左右，就可以看到靛蓝色。染色具体时间依据实验设计而定，可灵活变动。

显微成像

使用显微镜进行染色结果的记录，拍照可以调整几个参数，曝光值，自动白平衡，基本就这两个参数，尽量将背景拍得明亮一些，显得干净。拍摄之后要记得添加标尺scale，一般需要调整为一致的标尺。