基于二代测序的RNA癌症研究方法

• 基于DNA层面的癌症研究：一本字典

• 基于RNA的癌症研究：从字典种挑取写一篇日记

• RNA特点：
  时空特异性：需要控制变量对照组
  协同作用，形式多样：表达量高低/可变剪接/单碱基突变/融合基因，mRNA/lncRNA/miRNA/ceRNA...
  可控可逆，“温和”调节：治疗前后，短期发展进程

• 在设置对照组应尽量保证无环境或其他因素的干扰：如取同患者肿瘤与其癌旁组织；药物处理时选择同窝小鼠

• 重复性设置，排除随机波动

• 基因定量：FPKM/RPKM/TPM
  定量方法
  比对到参考转录组：RSEM，eXpress
  比对到参考基因组：cutdiff/cutffquant，HTseq
  不需比对（mapping free）：Sailfish，Kallisto，速度快

• 差异表达：foldchange，pvalue
  DESeq2等
  不够生物重复样本，NOISeq
  一般数目控制在百级别

• 功能数据库：GO/KEGG（适合genelist）

• 疾病相关数据库：OMIM/PharmGKB/GeneCards/COSMIC（适合单基因检索）

• 可变剪接：转录后调控形式（一个基因转录后选择不同外显子区域进行连接组合，形成不同的转录本亚型，并翻译成蛋白），哺乳动物尤为常见，人95%的多外显子基因都可能存在

  
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  可变剪接影响：蛋白功能/活性/作用位置
  癌症研究中，可变剪接结果不易理解和验证，不建议做结构研究（适合三代），因此优先级靠后

• 可变剪接研究方法
  基于转录本亚型定量：同一基因不同可变剪接亚型的比例，Cutffdiff/rSeqDiff/RSEM
  基于单个可变剪接事件（更常见，研究是否发生可变剪接现象）：外显子跳跃，内含子保留等单个事件，rMATS/DiffSplice

• 用转录组数据call SNP
  优势：更容易发现与功能相关的SNP
  挑战：基因表达丰度不同，覆盖度极不均匀；可变剪接的存在给外显子边缘SNP鉴定带来困难；RNA编辑干扰SNP鉴定
  流程：clean reads——HISAT比对——GATK call SNP——SNP过滤

• 融合基因
  癌症中特异的存在，因基因组上的倒位、易位、插入、缺失等大型结构变异造成。原本在染色体上距离较远，或者不在同一染色体上的基因距离接近，并一同转录形成融合转录本的现象。
  变异罕见，一般只出现在癌症/肿瘤组织中，是一种理想的biomarker。
  癌症中的融合基因：BCR-Abl（22chr——9Chr），Imatinib。白血病患者biomarker和药靶

  
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  融合基因的鉴定结果（少且易读）：哪些基因进行了融合，融合位置，reads支持数。易验证（设计PCR引物测序）

基于长读长测序的转录本结构研究

• 转录本长度一般1k-5k，二代平台（100-150bp）覆盖不了整条。基于短读长RNA-seq组装产生大量的嵌合体
• PacBIo读长10-40k，更利于研究可变剪接和转录本结构变异
• 基于长读长的融合基因研究
  二代测序只能确定有融合事件发生，获得融合位置一小段区域，三代可获取完整融合转录本序列和融合亚型

单细胞RNA-seq的癌症应用

• 常规RNA：组织——组织匀浆，RNA提取（平均化异质性）——测序
• 低通量，高深度单细胞技术：组织——挑选单细胞（流式细胞仪等）——单管单细胞（SMART-seq2），有偏的人为挑选，每个细胞单独建库，高深度，每个细胞能鉴定1-1.2万基因
• 高通量，低深度单细胞技术：组织——海量单细胞文库（基于微流控系统，10X Genomics/MGI DNBelab C4/BioRad），一次捕获1000-10000个细胞，每个细胞鉴定300-3000个基因，无偏
• 单管单细胞适合个体研究，针对同质性群体；高通量单细胞适合群体研究，针对异质性群体
• 高通量单细胞：细胞分群——marker gene（只在这类细胞中表达/高表达）
• 空间单细胞转录组：多一维位置信息，如针对肿瘤位置相关的研究，皮肤癌/实体瘤，尚不成熟

肿瘤基因组临床应用专题：
【1】 肿瘤医学研究前言进展
【2】肿瘤基因检测相关技术原理
【3】肿瘤基因组数据分析方法概述
【4】肿瘤转录组测序分析流程及相关软件
【5】肿瘤DNA甲基化数据分析原理及流程
【6】肿瘤胚系突变遗传分析及数据库使用
【7】基于NGS检测体系变异解读和数据库介绍
【8】肿瘤临床遗传咨询及案例分析