在RNA-seq 数据中鉴定lncRNA

最近读了一篇文章名为《LncPipe: A Nextflow-based pipeline for identification and analysis of long non-coding RNAs from RNA-Seq data》于2018年6月28号发表在《Journal of Genetics and Genomics》上，文章通过构建一个新的程序名为LncPipe 来帮助科研工作着从RNAseq数据中挖掘出lncRNA。
文章的原文是这么写的：
LncPipe is the first one-stop pipeline integrating all the essential softwares and analyses for exploring lncRNAs from RNA-Seq data。
one-stop pipeline 显得相当的有趣，怀着好奇的心态，来看看这个软件到底好不好用

1.软件的运行流程

我们可以看到整个软件的运行逻辑还是比较清楚的。
软件最大的特点是用 用R、perl、javascript、shell 将分析的各个流程衔接起来。
反正看起来比较牛逼的样子...

image.png

2.软件的安装

首先我们找到网站的站点....这个网站有2个站点
github:https://github.com/likelet/LncPipe
LncPipe:http://seqworld.com/LncPipe/
因为这是软件的组装，所以安装起来显得相当的麻烦
我们来看看软件的安装：

a.安装NextFlow

# Make sure that Java v8+ is installed:
java -version

# Install Nextflow
curl -fsSL get.nextflow.io | bash
#也可以通过conda 来安装
conda install -c bioconda nextflow 

# Add Nextflow binary to your PATH:
mv nextflow ~/bin/
# OR system-wide installation:
# sudo mv nextflow /usr/local/bin

第一步我们的nextflow就安装上去了

安装成功截图.png

第二步移动nextflow到指定文件夹（软件我都是放到一个专门的地方）

mv nextflow /data2/niexiongwei/Tools/nextflow/

第三步配置安装path

vim ~/.bashrc
source ~/.bashrc

image.png

到这里第一步nextflow就安装好了

b.安装pipeline

nextflow 能够联网访问Github 所以不用安装

c.pepline的配置

作者提供了3种配置方式Docker、Singularity、conda
很显然 Docker 是最好的选择...
首先是安装Docker环境
DOcker 安装还是比较简单的，需要注意的是需要弄清楚Linux 内核版本
我们以我的机器Ubantu 作为例子

curl -sSL http://acs-public-mirror.oss-cn-hangzhou.aliyuncs.com/docker-engine/internet | sh -
sudo apt-get -y install docker-ce

这个项目最大的亮点是用Docker封装了一个运行容器，就是这个安装有点扯...
我们来看看怎么运行的

3.软件运行

nextflow -c docker.config run LncRNAanalysisPipe.nf

4.准备参数

配置输入数据

  params {
        /*
            User setting options (mandatory)
             */
        // input file and genome reference
            fastq_ext = '*_{1,2}.fq.gz'
            fasta_ref = '/data/database/hg38/genome.fa'
            design = 'design.file'
            hisat2_index = '/data/database/hg38/hisatIndex/grch38_snp_tran/genome_snp_tran'
            cpatpath='/opt/CPAT-1.2.3'
            //human gtf only
            gencode_annotation_gtf = "/data/database/hg38/Annotation/gencode.v24.annotation.gtf"
            lncipedia_gtf = "/data/database/hg38/Annotation/lncipedia_4_0_hg38.gtf" // set "null" if you are going to perform analysis on other species

        // additional options for non-human species, else leaving them unchanged
            species="human"// mouse , zebrafish, fly
            known_coding_gtf=""
            known_lncRNA_gtf=""
         


        /*
            User setting options (optional)
             */
            // tools setting
            star_idex = ''//set if star used
            bowtie2_index = ''//set if tophat used
            aligner = "hisat" // or "star","tophat"
            sam_processor="sambamba"//or "samtools(deprecated)"
            qctools ="fastp"  // or "afterqc","fastp","fastqc"
            detools = "edger"//or "deseq2","noiseq" not supported yet
            quant = "kallisto"// or 'htseq'

            //other setting
            singleEnd = false
            unstrand = false
            skip_combine = false
            lncRep_Output = 'reporter.html'
            lncRep_theme = 'npg'
            lncRep_cdf_percent = 10
            lncRep_max_lnc_len = 10000
            lncRep_min_expressed_sample = 50
            mem=60
            cpu=30
        }

5.输出结果

 Result/
        ├── QC
        │   ├── N1141_1.clean_fastqc.html
        │   ├── N1141_2.clean_fastqc.html
        │   ├── N1177_1.clean_fastqc.html
        │   └── N1177_2.clean_fastqc.html
        ├── Identified_lncRNA
        │   ├── all_lncRNA_for_classifier.gtf
        │   ├── final_all.fa
        │   ├── final_all.gtf
        │   ├── lncRNA.fa
        │   ├── protein_coding.fa
        │   └── protein_coding.final.gtf
        ├── LncReporter
        │   ├── Differential_Expression_analysis.csv
        │   └── Report.html
        ├── Quantification
        │   ├── kallisto.count.txt
        │   └── kallisto.tpm.txt
        └── Star_alignment
            ├── STAR_N1141
            │   ├── N1141Aligned.sortedByCoord.out.bam
            │   ├── N1141Log.final.out
            │   ├── N1141Log.out
            │   ├── N1141Log.progress.out
            │   └── N1141SJ.out.tab
            └── STAR_N1177
                ├── N1177Aligned.sortedByCoord.out.bam
                ├── N1177Log.final.out
                ├── N1177Log.out
                ├── N1177Log.progress.out
                └── N1177SJ.out.tab

最后总结一下，这个软件数据配置是真的麻烦...
其最大的特点就是用程序将各个分析软件衔接起来了，希望能够一次输出结果，然而生物数据分析种会有各种各样的问题，一次打包运行可能会带来一些问题。
这个软件最后的总结就是，很鸡肋，安装配置相当麻烦，而且错误奇怪，不如自己动手安装流程一步步的分析...

6.后记

因为肺炎的原因，暂时不能回校，因此没办法用学校的服务器进行数据分析。
等疫情结束后，实际数据运行一次，看看最后的输出结果....
先留个尾巴在这里