Fluorescence and confocal microscopy

关于共聚焦显微镜Abcam的介绍
https://s1885709864.t.eloqua.com/e/f2?LP=1142

一、扫描方式

• 强激光点扫描，速度较慢，可能会导致标记样本的一些荧光染料发生光漂白
• 扫描越慢，噪声越少，越容易发生光漂白
• 避免漂白：Laser power尽可能低

二、荧光染料很重要

• 量子产率=荧光染料释放的光子量与荧光染料吸收的光子量的比值
• 推荐Alexa Fluor染料
• AF488 绿色，AF568 红色 合并在一起黄色
  -常用组合AF488+AF633/647
• 区分Excitation 和Emission
• 基本上，染料不会只在一个波长处被激发，而是在某个波长范围。要注意染料不会被其他通道的激光非特异性激发。发射光同理，注意分离串色，一定要精挑细选要测量的波长长度。
• 每个通道顺序扫描，不容易串色！！！！！！！！

三、对照

1. 阳性对照：如果不确定抗体是否生效，也许需要采用一种确定有效的抗体或染料
2. 阴性对照：只用二抗，看是不是会乱染色，是否会混杂在不应该结合的位置
3. 空白对照：不染色，排除自发荧光
4. Isotype control/单阳对照：相当于流式中的单阳管，用来调补偿

四、三维成像

-Importan to check that the image you acquired is not saturated or undersampled