Exon-intron circular RNAs regulatetranscriptionin the nucleus

EIciRNA在细胞核内调控自身基因的转录

影响因子：12.5

一、circRNA调控机制

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本文阐述的是一类由外显子和内含子序列构成的circRNA，这类circRNA由亲本基因转录后的RNA经过剪切加工形成含有外显子和内含子序列的环状RNA，然后环状RNA与U1和U1结合蛋白复合体结合后结合到亲本基因的启动子区，与Pol II互作促进亲本基因的转录。

二、核心实验和结果

1、鉴定细胞中的由外显子和内含子构成的这一类环状RNA，作者首先通过预测的circRNA分别设计解聚引物和发散引物（如A右图）进行q-pcr检测验证几种circRNA，然后分别用外显子序列和内含子序列作为探针进行Northern blot来验证circEIF3J和circPAIP是由外显子和内含子组成的，然后通过FISH对circEIF3J和circPAIP进行细胞内的而定位。

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图A为用聚集引物和发散引物进行Q-PCR检测细胞中的circRNA图B分别用外显子和内含子序列探针进行Nothern blot检测，并用RNaseR消化线性RNA，表明circEIF3J由外显子3/4和它们之间的内含子构成, circPAIP2由外显子2/3和它们之间的内含子构成。图C为FISH，分别用构成环状的外显子序列和内含子序列作为探针进行荧光原位杂交检测，表明circEIF3J,circPAIP2位于细胞核内。

2、本文的第二个核心实验是为了说明circEIF3J, circPAIP2结合到自身亲本基因上调控基因的转录。作者通过对circEIF3J, circPAIP2敲低后检测亲本基因转录的mRNA的表达来说明circRNA对亲本基因的调控，然后通过FISH对circRNA和亲本基因进行细胞内的定位显示两者存在细胞中相同位置，说明circRNA通过与亲本基因互作调控基因的转录。

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图A是对circEIF3J, circPAIP2敲低后检测细胞circRNA和亲本基因转录的MRNA的表达，表明circRNA敲低后circRNA和亲本基因转录的mRNA的表达都降低了。图B是分别用circEIF3J, circPAIP2探针和亲本基因探针检测细胞内的circRNA探针和亲本基因，表明circRNA与亲本基因有互作关系。

3、本文的第三核心实验是验证circEIF3J, circPAIP2与Pol II, U1 snRNP互作结合到亲本基因启动子上促进基因转录。作者分别通过RNApull-down，RNA-RNApull-down，CHIRP，RIP，ChIP，FISH等实验进行验证。

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图A是RNA pull-down，用circRNA探针钓取细胞中与之结合的蛋白，然后进行WB检测，表明circEIF3J,circPAIP2与PolII, U1A、U1C结合。图B是RNA-RNA pull-down，用circRNA探针钓取细胞中与之结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明circEIF3J,circPAIP2与U1结合。图C是CHIRP，用circRNA探针钓取细胞中与之结合的染色体片段，然后进行q-pcr检测，表明circEIF3J,circPAIP2与其亲本基因启动子结合。图D是RIP，分别用U1A和U1C抗体钓取细胞中与相应蛋白结合的RNA，然后进行q-pcr检测，表明circEIF3J,circPAIP2与U1A、U1C结合。图E是ChIP，分别用U1A和U1C抗体钓取细胞中与相应蛋白结合的染色体片段，然后进行q-pcr检测，表明U1A和U1C与基因启动子结合。图F是FISH，用circEIF3J, circPAIP2与U1snRNA探针进行RNA的细胞内定位，表明circEIF3J,circPAIP2与U1snRNA有互作关系。

4、将Gas5表达质粒转染细胞后检测GR应答相关基因的表达，然后通过ChIP实验说明基因的表达是受Gas5与GR互作抑制。

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图A是Gas5表达质粒转染细胞后，用Dex处理，然后检测细胞GR诱导的基因mRNA的表达，表明Gas5表达使mRNA表达降低。图B是ChIP实验，Gas5表达质粒转染细胞后，用Dex处理，然后用GR抗体钓取细胞中与GR/GRE结合的DNA片段，进行q-pcr检测，表明Gas5表达使GR/GRE与基因启动子结合降低。

参考文献：

Zhaoyong Li,Chuan Huang,Chun Bao,et al. Exon-intron circular RNAsregulate transcription in the nucleus［J］. Nature structural & molecular biology,2015, 10.1038/nsmb.2959