4-1BB共刺激结构可以缓解CAR-T细胞的tonic信号诱导的
一、背景
CAR-T是一种有效的治疗肿瘤的方法，但是靶点的特异性、CAR-T细胞在体内的持久性都是需要研究人员去攻克的一个问题，CAR-T细胞在体内的非抗原依赖的激活会导致CAR-T的衰竭从而限制了疗效。作者发现使用4-1BB共刺激域相比于CD28更有利于CAR-T细胞活性的长期维持。
二、结果
作者设计了靶向GD2的CAR结构，然后使用了GD2.28z CAR、GD2.28z CAR进行体内体外的杀伤实验发现，在体外具有明显的杀伤活性但是在体内却不能发挥相应的作用，比较了GD2.28z CAR和GD2.28z CAR的结构，应该不是由于spacer的存在造成的，作者又用靶向CD19的CD19.28z CAR结构进行实验，发现体内外都有很好的效果，于是作者进一步分析这两者的差异。
首先为了控制肿瘤差异造成的影响x，作者构建143B稳定表达CD19的细胞系（143B-CD19），体外杀伤实验表明，分别含有GD2.28z CAR and CD19.28z CAR结构的T细胞具有相近的杀伤能力，但是体内实验表明，只有CD19.28z CAR T细胞具有一定的杀伤作用，而GD2.28z CAR T细胞没啥作用。抗肿瘤的效果会和T细胞在体内的增殖和持久性有关，在car-T细胞进入小鼠体内14天后，作者发现仍有CD19.28z CAR T细胞的存在，但是并没有发现GD2.28z CAR T细胞。
接着作者对GD2.28z和CD19.28z T细胞的扩增过程中的各种细胞特性进行测定，在T细胞活化第5天时，GD2.28z T细胞相比于CD19.28z T细胞和对照组细胞，体积增大，具有更高的CD25和4-1BB表达量以及更低的CD27和CD127表达量，尽管GD2.28z T细胞有着这些变化，但是到了第九天后，却表现出更低的增殖活性和具有更高的凋亡比例，GD2.28z T细胞出现了衰竭的特征，比如PD-1, TIM-3、LAG-3以及衰竭相关的转录因子T-bet、Blimp-1表达的上调。此外，当GD2.28z和CD19.28z T细胞分别与143B-CD19结合后，GD2.28z T细胞分泌很少的TNF-α、IFN-γ、IL-2，而且往car-T细胞中添加IL-2、IL-7进行培养并不会影响衰竭的表象，上述实验表明GD2.28z T细胞出现了比较快速的衰竭，而CD19.28z T细胞没有发生类似的情况。
为了进一步确认较差的细胞因子分泌能力是因为T细胞衰竭而不是因为CAR-抗原的相互作用效力不同，作者构建了共表达CD19.28z和GD2.28z CARs的T细胞，当共表达的car-T细胞与143B-CD19和NALM6-GL细胞分别接触后z，共表达两种car结构的细胞会分泌较少的细胞因子，另外在体内也是类似的结果，因此car-T细胞的衰竭与CAR-抗原相互作用无关，和GD2.28z CAR的表达有关。
作者接下来分析导致衰竭的机制。表达CD19.28z CAR或GD2.28z CAR的T细胞都使用anti-CD3/CD28 beads进行激活扩增，但是GD2.28z CAR T细胞表现出更早的衰竭，作者先检测了CD3-ζ的磷酸化状态，结果发现表达GD2.28z CAR的T细胞在未刺激的情况下仍能检测到磷酸化的CD3-ζ，为了确认GD2.28z CAR在衰竭发生中的关键作用，作者将在CD28和CD3-ζ区域发挥信号转导作用的关键点进行点突变，进而消除了通过GD2.28z CAR发挥信号转导功能的可能，扩增实验结果表明表达突变型GD2.mut-28.mut-z CAR的T细胞没有出现活化信号并且也没有衰竭的发生。
作者使用idiotype-specific抗体引起CD19.28z CAR T细胞的tonic信号y，实现了类似GD2.28z CAR T细胞衰竭的过程。
为了找到引起的tonic信号的因子，作者先分析了T细胞表明是否有GD2蛋白以及合成GD2所需各种酶类的表达，结果表明并没有，然后怀疑是低表达的GD2或者游离在培养基中的可溶性的GD2以及其他类似抗原造成的tonic信号，所以作者将GD2.28z CAR上的抗原结合域突变去除抗原结合能力，这个CAR表达在T细胞中后，不会引起目的细胞的裂解但是仍然会明显的引起细胞衰竭，因此推断tonic信号不是由GD2或者培养体系中的其他物质造成的。
非抗原依赖性的信号转导与CAR结构本身有关，有很多研究表明scFV会形成多聚体，作者推测是GD2.28z CAR的scFv造成了受体聚集和tonic信号转导，将CAR和荧光蛋白融合后发现，CD19.28z CARs均匀的分布在T细胞表面而GD2.28z CARs则形成聚集点分布在细胞膜上，CAR的具体不是因为信号传递而主动聚集，因为突变型的GD2.mut-28.mut-z CAR依然形成斑点状，该实验表明tonic信号是GD2.28z CARs互相作用聚集造成的。
CD19.28z 和GD2.28z CARs之间在linker和spacer结构上有一定的区别，作者将CD19.28z CAR scFv结构换成GD2.28z CAR scFv后，T细胞发生了较早的衰竭，作者还构建了可溶性的GD2 scFv以及CD19 scFv，并没有发现可溶性的scFV与T细胞有结合，以上实验说明tonic信号是由GD2.28z CAR自身具体造成的。
作者进一步探索tonic信号的产生是否是GD2.28z CAR独有的，作者又分别在T细胞中表达了三种CAR，两种靶向（CD22）、一种靶向ErbB2，所有CAR都包含与GD2.28z CAR相同的CD28-CD3-ζ信号结构域，体外培养这些car-t细胞后发现会有着不同程度的激活，作者的结论是car-T细胞的早期衰竭程度是基因不同scFV普遍存在的。
一些临床实验表明有着不同共刺激域（CD28或者4-1BB）的CD19 CAR T细胞表现出不同的持久性，衰竭的T细胞有着更差的持久性，所以作者想评估共刺激域是否会影响衰竭的发生。作者使用GD2 CAR作为模型进行测试，比较了同时具有CD3-ζ和CD28（WT）的共刺激域和分别拥有CD3-ζ、CD28结构的差别，结果发现WT会产生更明显的衰竭表型。
接着作者用4-1BB代替了CD28结构域来看看T细胞衰竭情况，结果表明含有4-1BB CAR的细胞表现出更低的衰竭程度并且分泌更多的细胞因子和更好的抗肿瘤效果，同时在体内有着更高的持久性。治疗白血病小鼠中，4-1BB也有很好的表现，总之CD28会引发衰竭信号，而4-1BB会减缓这种信号诱导的不良影响。
最后作者对表达未转染的T细胞、分别表达GD2.28z、GD2.BBz、CD19.28z、CD19.BBz CAR的细胞进行高通量测序分析4-1BB减缓衰竭的分子途径，首先主成分分析表明，相比于GD2.28z和GD2.BBz CARs的T细胞，表达CD19.28z and CD19.BBz CARs的T细胞与未转染的T细胞有着更相近的表达谱，GSEA分析表示GD2.28z CAR T细胞相比于CD19.28z CAR T细胞，有些衰竭相关的基因表达被上调，表达GD2.BBz CARs的T细胞也仍有部分衰竭的基因上调，不过GD2.28z CAR T细胞与GD2.BBz CARs的T细胞之间这些与衰老相关的基因以及抑制性受体的表达量还是有所差别，因此有助于GD2.BBz CARs T细胞的功能发挥。
作者还对GD2.28z 和GD2.BBz CAR T细胞进行了无差异的比较分析（unbiased comparisonsy），得到了一些与缺氧反应、凋亡等通路的基因信息，另外作者对GD2.28z,、GD2.BBz、CD19.28z CAR T细胞这三组转录组数据进行联合分析，找出了在GD2.28z CAR组中特异性表达失调而在GD2.BBz CAR中表达正常的基因，这些基因与之前的GSEA分析中有很多类似的，这些数据表明4-1BB会减少衰竭相关基因的表达或者对细胞凋亡等基因的调控来缓解T细胞衰竭的过程。
论文链接：
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4458184/
