蛋白质测序中的氨基酸分离与定量

蛋白质测序是确定全部或部分蛋白质或肽的氨基酸序列的实际操作程序。蛋白质测序也可以用来鉴定蛋白质或表征其翻译后修饰。通常情况下，蛋白质的部分测序就可以提供足够的鉴定信息（一个或多个序列标签）。

蛋白质测序的两种主要直接方法是质谱法和使用蛋白质测序仪（测序仪）进行的Edman降解法测序。目前使用最广的蛋白质测序和鉴定方法是质谱法，而Edman降解则是表征蛋白质N端最重要的方法之一。

确定蛋白质的氨基酸组成

通常我们希望能在找到有序序列之前先知道蛋白质的氨基酸组成，这有助于我们发现测序过程中的错误并修正最终结果。了解蛋白样品中氨基酸的组成，可协助判断哪种蛋白酶才适用于该蛋白质的水解，此外还可以确定蛋白质中低水平非标准氨基酸（例如正亮氨酸）的掺入错误。确定氨基酸组成的通用方法通常被称为氨基酸分析：

1. 将已知数量的蛋白质水解成其组成成分氨基酸；

2.以合适的方式分离并定量氨基酸。

蛋白质水解

通过将蛋白质样品在6 M盐酸中加热到100–110 °C，并保持该温度24小时或更长时间来完成水解，有许多庞大的疏水基团的蛋白质可能需要更长的加热时间。但是，因为这些反应条件非常剧烈，以至于某些氨基酸（丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，色氨酸，谷氨酰胺和半胱氨酸）会发生降解。为解决此问题，Biochemistry Online建议可以通过给不同的样品加热不同的时间，分析每种生成的溶液，并推测零水解时间。Rastall建议使用各种能够防止或减少降解的试剂，例如硫醇试剂或苯酚，以保护色氨酸和酪氨酸不受氯的侵蚀，并预氧化半胱氨酸。他还建议通过测量氨的释放量来确定酰胺水解的程度。

氨基酸分离与定量

可以通过离子交换色谱法分离氨基酸，然后进行衍生化来帮助检测。更常见的方法是将氨基酸进行衍生，然后通过反相HPLC来解决。

以NTRC提供的离子交换色谱法为例：使用磺化聚苯乙烯作为基质，将氨基酸加入酸溶液中，用逐渐增加pH的缓冲液冲洗柱子。当pH达到其各自的等电点时，氨基酸被洗脱。一旦氨基酸被分离，就加入可形成有色衍生物的试剂即可确定各氨基酸的量。如果氨基酸的量超过10 nmol，可以使用茚三酮；与脯氨酸反应时为黄色，与其他氨基酸反应时为鲜紫色。氨基酸的浓度与所得溶液的吸光度成正比。只需要少量（低至10 pmol）该溶液，就可用邻苯二甲醛（OPA）或荧光胺等试剂形成荧光衍生物。柱前衍生化可使用Edman试剂来产出能被紫外光检测到的衍生物，使用能产出荧光衍生物的试剂可获得更高的灵敏度。衍生的氨基酸通常使用C8或C18硅胶柱和优化的洗脱梯度进行反相色谱分析。使用UV或荧光检测器检测洗脱的氨基酸，并将峰面积与衍生标准品的峰面积进行比较，便可以完成对每种氨基酸的定量分析。

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