一、测序过程和原理

Illumina测序是基于可逆终止的、荧光标记dNTP来做边合成、边测序的工作。

Flowcell（流动池）里面做了8条通道，通道的内表面做了专门的化学修饰，即用两种DNA引物通过共价键（不会被冲掉，稳定）将其种在内表面，这两种DNA引物序列与要测序的DNA文库的接头序列相互互补。 image.png
包括以下四个步骤：

1.DNA文库构建

DNA文库是许多DNA片段在两头接上了特定的DNA接头，形成的DNA混合物。有两个特点：1.中间插入序列各种各样2.两头的接头序列是人为插上去的。制作步骤为：超声波将DNA分子打断成300-800bp长序列片段，用酶补平为平末端，然后3‘端加一个A碱基（因为接头的3‘端有一个突出的T），再用连接酶将特定的接头连上去。再在两端加上互补配对的adapter，再通过PCR扩增达到一定浓度，构成单链DNA文库。

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2.桥式PCR

桥式PCR是将DNA文库种到流动池上进行扩增的过程。文库中两头的DNA序列和芯片上引物是互补的，产生互补杂交。杂交后加入dNTP和聚合酶，合成新的DNA链。加入NaOH解链，与芯片共价连接的链被保留。再加入中性液体中和碱液，环境变成中性，这时DNA链上另外一段与芯片上第二段引物发生互补杂交。加入dNTP和聚合酶，聚合酶沿着第二条引物合成出一条新的链。再加碱，再中和，再加酶，再加dNTP，DNA链的数量就会以指数方式增长。
桥式PCR完成后，就要把合成的双链变成可以测序的单链。即通过某一特定的碱性物质将一个引物上特定的基团切断，再用碱溶液清洗芯片。再加入中性溶液，加入测序引物，开始测序。

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3.测序

测序时主要加入两种物质，一个是带有荧光标记、3‘末端被叠氮基堵住的dNTP，另一个是聚合酶。因为dNTP 3‘末端被叠氮基堵住，所以一个循环只能延长一个碱基。然后用水把多余的dNTP和酶冲掉，放到显微镜下进行激光扫描，根据发出来的荧光判断是哪种碱基（红黄蓝绿），然后再推出模板上的碱基是哪个。这个循环完成后，加入化学试剂，将叠氮基团和荧光基团切掉，3‘端的羟基暴漏出来。接下来加入新的dNTP和新的酶，又延长一个碱基，再冲掉，再扫描，再读出来。
读index。在文库的接头上做标记。每一个样本中含有一个特定的接头，每个接头里含有一段特定的序列，称为index。读index序列前，先用碱把测完的read1序列解链掉，然后加入中性链，加入read2的测序引物，进行第二轮测序。就可以知道该DNA来自于哪个样本。

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双端测序，一根DNA链从正向和反向各读一遍。先合成互补链，用化学试剂，在根上将原来的模板连切掉，剩下互补链。进行read3的测序。

4.数据产出

二、测序类型

第一代DNA测序技术-双脱氧链终止法。

第二代DNA测序技术-NGS循环阵列合成测序法，。读长短，pcr技术增加了测序的错误率

第三代DNA测序技术-纳米孔单分子测序技术，超长读长，错误率高。

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