文献学习070--[sc]细菌性败血症的免疫图谱

2020年发表在nature medicine上的sepsis患者外周血pbmc单细胞图谱

脓毒症是一种高死亡率的高发病，占全球医疗保健支出的很大一部分。迄今为止，没有任何用于脓毒症的诊断性生物标志物或靶向治疗剂被证明是有用或有效的。这可能是由于多种潜在病原体、感染部位、个体化宿主免疫反应和器官功能障碍表现导致的显著疾病异质性。同样，目前对脓毒症诱导的全身免疫失调的细胞和分子基础的了解十分有限。先前的患者基因表达谱研究依赖于全血来表征诊断或预后基因特征，这种方法可以聚合来自许多不同细胞类型的转录组信号，很可能丢失来自低占比细胞的特征，也不能识别细胞类型- 特定疾病特征。为了克服这些限制，我们使用单细胞解析的基因表达谱来表征脓毒症患者血液中的免疫细胞状态谱。

1. scRNA-seq defines immune cell states in sepsis patients across multiple clinical cohorts

Fig 1a, b：作者纳入了19例HC；
UTI (尿路感染)队列：10例Leuk-UTI (UTI with leukocytosis, but no organ dysfunction )，7例Int-URO (UTI with mild or transient organ dysfunction)，10例Urosepsis, URO (UTI with clear or persistent organ dysfunction)。
Bac-SEP队列：4例 (bacteremic individuals with sepsis in hospital wards)
ICU队列：admitted to the medical ICU either with sepsis (8例, ICU-SEP) or without sepsis (7例, ICU-NoSEP)；
对所有样本的外周血PBMC进行了单细胞测序。

这里不是直接就测了PBMC，还对DC做了富集 (LIN^–CD14^–HLA-DR⁺)，然后用cell hashing做了混样。

Fig 1c-e：患者的年龄、入院时间、病原等基本信息
Fig 1f：一共得到10654个PBMC和19806个DC。

2. Expansion of a monocyte state, MS1, in the blood of subjects with sepsis

Fig 2a, b：注释得到6类细胞，二次聚类得到15个cell state，每个state具有不同的marker基因。
Fig 2c：随后作者计算了大群和亚群在各组间的比例变化，其中作者发现MS1在Int-URO和URO中比HC和Leuk-URO显著更高，在Bac-SEP中也升高，ICU-SEP也高于ICU-NoSEP。

鉴于 MS1 在脓毒症患者中的扩增，我们推断分析 MS1 细胞内的基因表达特征可能会有助于得到脓毒症的有用临床标志物并进一步了解生物学机制。
Fig 2d, e：作者比较了ICU-SEP和ICU-NoSEP中MS1的转录差异，得到了MS1在ICU-SEP中上调的基因，其中最显著的基因包括PLAC8和CLU。
Extended Data Fig. 7d-f：作者对MS1使用非负矩阵分解得到5个模块 (MS1A-E)
Fig 2f, g：模块MS1-A主要与线粒体呼吸有关 (MT-ND4, MT-CO3, MT-ATP6)，并且与SOFA评分(疾病严重程度)正相关。提示能量代谢改变和败血症免疫抑制状态之间的内在关联。模块MS1-B则主要与抗炎和pro-resolving反应相关(S100A8, RETN, ALOX5AP, FPR2)，与疾病严重程度负相关。这与患者的早期免疫过度活化而晚期免疫抑制相一致。

Fig 2 Extended Data Fig. 7

附：SOFA评分

3. Validation of MS1 signatures as markers for sepsis

Fig 3a：为了将作者得到的signature和此前文献中报道的分类器做比较，作者使用ROC分析了MS1 fraction、MS1细胞的PLAC8 + CLU表达和published gene-based signatures对sepsis的诊断效能。发现当分析所有的sepsis (Int-URO, URO, Bac-SEP and ICU-SEP) 和对照 (Control和Leuk-UTI) 时，MS1 fraction的诊断效能最好。当分析ICU-SEP和ICU-NoSEP时，MS1细胞的PLAC8 + CLU 表达具有最准确的诊断效能。

随后作者使用了公开的bulk sepsis数据集对该signature的诊断效能进行了验证。作者对spesis数据集进行了反卷积以推断其中的MS1 fraction。（和单细胞和空间转录组分析揭示结直肠癌中FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的相互作用有点像哦，先找signature，然后找公开的bulk数据集反卷积做验证。）
Fig 3b, d：11个sepsis数据集都显示其MS1 state的inferred abundance在sepsis患者中更高 (summary effect size of 1.9 across all cohorts, FDR=1.75×10^–30)。而推断的MS1 fraction在不同数据集中都可以被用于sepsis的诊断 (summary AUC of 0.90, range of 0.81–0.98)。
Fig 3c, e：在另外的7个数据集(sepsis vesus ICU control)中，MS1 fraction诊断效能不佳，而PLAC8, CLU 和 MS1 marker 基因 (RETN, CD63, ALOX5AP, SEC61G, TXN 和 MT1X)则可以很好的对sepsis 和 ICU control 进行分类。

Fig 3

This analysis of published transcriptional data implies that MS1 cells are present in people with sepsis across several geographic locations, genetic backgrounds and clinical contexts, and demonstrates the potential utility of MS1-specific gene signatures for the discrimination of sepsis from sterile inflammation.

4. Surface markers for isolation of MS1 cells

为了进一步提高MS1 signature的细胞marker utility，作者鉴定出了表面蛋白panel，用于流式鉴别MS1的state。
Fig 3f：在和其他14单核相比的差异基因中，MS1特异性低表达HLA-DR，高表达IL1R2。sepsis患者是HLA-DR^loIL1R2^hi。
Fig 3g：此前的文献报道sepsis患者存在HLA-DR的低表达^1,2，但作者发现HLA-DR^lo在Leuk-UTI中也存在。单独的HLA-DR^lo不足以将sepsis 和其它 uncomplicated infection区分开来。但HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺细胞在Int-URO 和 URO中比Control 和 Leuk-UTI 都显著要高。
Fig 3h, i：而且流式检测到的细胞比例和单细胞检测到的比例呈正相关 (Pearson r = 0.87) 。而且分选的HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺细胞可以很好的代表MS1特征。

外周血单核细胞MHC分子的表达下调也出现在：
COVID-19： 重症COVID-19患者的外周免疫反应单细胞图谱；
急性川崎病：急性川崎病外周血PBMC单细胞测序；
BNT162B2诱导的心肌炎：单细胞测序解析BNT162B2诱导的心肌炎中经典单核细胞的转录改变；
胰腺炎：胰腺炎及恢复期的外周血/组织单核巨噬细胞的新亚群及标志物
trauma：Previous reports from trauma patients indicate a similar reduction in HLA-DR expression on monocytes during initial injury, with potential link to clinical outcome. (见胰腺炎那一篇)
sepsis：此前有文献报道sepsis患者存在HLA-DR的低表达^1,2，该篇研究显示单独的HLA-DR^lo不足以将sepsis 和其它 uncomplicated infection区分开来。

Low HLA-DR expression is associated with monocyte immaturity, resulting in decreased responsiveness to stimuli^3,4. （该篇研究显示这些Low HLA-DR细胞是骨髓细胞 分化来的，不是外周细胞分化来的）

Fig 3

This combination of cell surface markers could be used to purify the cell state for further molecular and functional characterization, or could potentially be employed as a routine tool for rapid quantification of the MS1 fraction in people at risk of sepsis.

5. Generation of MS1-like cells from human bone marrow

由于HLA-DR的低表达与monocyte immaturity有关，引起细胞应对刺激时的低反应性^3,4，作者因此推测MS1可能来自bone marrow mononuclear cells (BMMCs, 主要包括hematopoietic precursors，而不是外周成熟免疫细胞)。
Fig 4a：作者发现使用Pam3CSK4 (Pam3)或LPS慢性刺激BMMCs可以诱导出HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺细胞。
Fig 4b：而且HLA-DR^loIL1R2^hiCD14⁺细胞占CD14⁺细胞的比例在LPS或Pam3刺激的BM细胞中呈时间依赖性增加，而LPS或Pam3刺激的PB细胞则没有这种现象。
Fig 4c, d：对Pam3或LPS慢性刺激BMMCs进行单细胞测序的结果显示，一群显著高MS1 score的细胞在刺激组存在，在未刺激组不存在。
Fig 4e：轨迹分析显示：这群MS1-like induced population (iMS1)最初和未刺激的细胞具有一样的分化轨迹，但随后偏离了正常轨迹。
刺激组的progenitor细胞和未刺激组相比展示出一系列的差异性高表达基因 (Extended Data Fig. 10h)，包括一些参与inflammation-induced myelopoiesis 基因 (比如 IL3R, IL10R, IFNAR1)，提示外周血中的MS1细胞可能是sepsis-induced myelopoiesis的结果。

These results demonstrate the potential of human bone marrow cells as a model for the expansion of the MS1 state in sepsis, and support the hypothesis that the emergence of reprogrammed myeloid cells in the blood stems from dysregulated differentiation of hematopoietic precursors.

6. Epigenomic landscape and transcriptional regulators of MS1 cells

随后，作者对PB-Mono (正常外周血单核), PB-MS1 (sepsis患者外周血MS1), BM-Mono (正常骨髓单核细胞), 和 BM-iMS1 (LPS和HSC刺激BMMCs诱导的单核)进行了ATAC-seq。
Fig 4f：PCA结果显示PB-Mono和BM-Mono 在PC1和PC2上重叠，而B-MS1 和 BM-iMS1 则具有各自的特征(但具有类似的PC2)
Fig 4g, h：随后作者进行了motif enrichment analysis，PB-Mono 和 PB-MS1的差异性peak包括FOS–Jun, PU.1 和 CEBP motifs，它们都对单核细胞的发育至关重要。
鉴于此前报道中这些motif在inflammation-induced myelopoiesis中发挥重要作用，作者进一步分析了CEBP转录因子的表达。
Fig 4i：Bulk RNA-seq显示和PB-Mono相比，PB-MS1存在CEBPD 和 CEBPE 的表达增加以及CEBPG的表达下降。BM-iMS1和BM-Mono相比也是类似的结果。
Fig 4j：在iMS1的分化轨迹中也存在着沿时间轴的CEBPD 和 CEBPE 的表达上调以及CEBPG的表达下降。
有趣的是，前面Extended Data Fig. 7f中显示CEBPD是MCS1-C模块的特征基因，提示了其在维持MS1 program中的潜在重要性。

Altogether, these analyses show that MS1 cells have an epigenomic profile markedly different from that of normal CD14+ blood mono- cytes, and that these differences are associated with transcription factors involved in monocyte differentiation. Although in vitro- generated BM-iMS1 do not fully recapitulate the epigenomic land- scape of MS1 cells, the two populations show significant overlap in accessible peaks and share the upregulation of similar transcrip- tional regulators.

Fig 4

7. Functional response of MS1 cells to restimulation

为了比较MS1和其他CD14⁺单核细胞的functional response，作者分选了四种单核细胞群，在resting for 24 h后使用100 ng ml^–1 LPS 进行了刺激。
Fig 4k：结果显示LPS刺激后PB-MS1显著上调了细胞因子分泌和NF-kB通路相关基因。
Fig 4l-m：但PB-MS1对LPS的反应性和PB-Mono相比显著下降，BM-iMS1和BM-Mono相比也下降。
Fig 4n：各组差异表达基因分析显示PB-MS1存在特异性上调的基因，包括CLU (one of the genes we propose as a marker for discriminating sepsis from noninfectious inflammation)。此外，值得注意的是NFKBIA (a known inhibitor of inflammatory responses) 在PB-MS1 和 BM-iMS1中都下降，可能与两群细胞的blunted response有关。

Fig 4

This analysis demonstrates that MS1 cells from people with sepsis and those induced from human bone marrow both have a dysregulated response to further bacte- rial stimulation, recapitulating known phenotypes of monocytes in people with sepsis.

参考文献：

1. Gossez, M. et al. Proof of concept study of mass cytometry in septic shock patients reveals novel immune alterations. Sci. Rep. 8, 17296 (2018).
2. Landelle, C. et al. Low monocyte human leukocyte antigen-DR is independently associated with nosocomial infections after septic shock. Intensive Care Med. 36, 1859–1866 (2010).
3. Veglia, F., Perego, M. & Gabrilovich, D. Myeloid-derived suppressor cells coming of age. Nat. Immunol. 19, 108–119 (2018).
4. Schrijver, I. T., Théroude, C. & Roger, T. Myeloid-derived suppressor cells in sepsis. Front. Immunol. 10, 327 (2019).