2021-10-31

Nature | 正常上皮中的突变克隆可以消除新出现的肿瘤

原创 骄阳似我 图灵基因 今天

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

IF：49.962 

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1.      本文显示大多数新形成的食管肿瘤通过与邻近正常上皮中的突变克隆竞争而消除。在食管癌发生的小鼠模型中追踪了新生的，微观的，恶变前的肿瘤的命运，发现大多数肿瘤迅速丧失，没有肿瘤细胞死亡迹象，增殖减少或抗肿瘤免疫应答。

2.      对10日龄和1岁肿瘤的深度测序显示了对存活肿瘤进行选择的证据。在转基因小鼠中诱导高度竞争性克隆增加了早期肿瘤去除，而克隆竞争的药理学抑制减少了肿瘤损失。

3.      这些结果支持一种模型，其中早期肿瘤的存活取决于它们相对于周围正常组织中突变克隆的竞争适应性。正常上皮中的突变克隆在通过细胞竞争清除早期肿瘤中具有意想不到的抗肿瘤发生作用，从而保持组织完整性。

癌症驱动基因的体细胞突变在表型正常的成年人上皮细胞中很常见，例如食道，皮肤，子宫内膜，肺，膀胱和结肠。这些突变中的一些在正常组织中比在肿瘤病变中更普遍，表明正常上皮中的突变克隆可能具有意想不到的抗癌保护作用。然而，尚不清楚在早期肿瘤发生过程中，新出现的肿瘤的发展是否受到与周围正常上皮中强烈选择的突变克隆竞争的影响。近期，在Nature杂志上发表了一篇名为“Mutant clones in normal epithelium outcompete and eliminate emerging tumours”的文章，在食管癌发生的小鼠模型中研究了这个问题。

小鼠食管上皮由连续分裂的单个祖细胞基底层组成。分裂细胞产生祖细胞和分化子代的可能性相等，然后离开基底层，迁移到组织表面并脱落。祖细胞和分化细胞的平衡产生维持组织稳态。一些突变导致产生祖细胞的可能性增加，从而赋予突变细胞相对于其较不适合的邻居的竞争优势。施用二乙基亚硝胺（DEN），一种存在于烟草烟雾中的诱变剂，在饮用水中诱导小鼠食管上皮细胞的多种突变。具有竞争性“赢家”突变的细胞形成在增殖性基底细胞层中横向扩增的克隆，直到它们与具有相似适应性的其他突变体碰撞，此时它们返回中性漂移。随着时间的推移，正常上皮细胞中的突变克隆经历选择，因为它们竞争基底层中有限的空间，并产生类似于正常老化的人类食管中发现的突变景观。除了基底层细胞密度略有增加外，大多数组织在表型上保持正常。然而，DEN治疗也导致散布在组织中的离散癌前肿瘤的形成。因此，DEN给药构成了在早期癌发生过程中研究新生肿瘤与邻近正常上皮中的突变克隆之间相互作用的理想模型。图1：小鼠食管上皮的结构和动力学。

肿瘤或肿瘤被定义为组织的异常生长，并且可以是良性或恶性的。为了研究新出现的肿瘤与周围上皮细胞突变克隆相互作用的动力学，首先描述了DEN暴露后10天早期肿瘤的发展，并在接下来的18个月中进行了研究。在多个时间点，收集整个食管上皮细胞，染色细胞核和应激标记蛋白角蛋白6（KRT6），并通过共聚焦显微镜以单细胞分辨率以3D成像。肿瘤是从他们的异常形态和与正常上皮相比，KRT6染色强。在DEN产生的肿瘤中也观察到在人和小鼠的鳞状肿瘤中诱导的高水平的KRT17-a角蛋白，其调节信号传导和转录。这种技术能够在DEN停药后10天在每个食管中检测到数百个“微肿瘤”。这些直径小至约30μm，含有少至约20个细胞，并且表现出发育不良的轻度组织学特征。尽管它们的大小，这些病变中约35%显示血管生成的早期迹象。出乎意料的是，肿瘤数量在接下来的几个月中迅速下降，然后趋于稳定。持续病变的大小持续增长，从三个月起，分析的所有肿瘤均表现出复杂的血管网络。在DEN暴露后1年，肿瘤显示发育不良的迹象，其特征在于明显的角化过度和轻度至中度炎症，并且在18个月时观察到鳞状细胞癌。得出结论，虽然持续存在的肿瘤具有转化特征，但大多数微观肿瘤在形成后很快就会消退。图2：大多数食管肿瘤随着时间的推移而消失。

为了深入了解早期肿瘤如何丢失，比较了DEN暴露后10天和1年收集的肿瘤的突变情况。涉及上皮癌发生的192个基因的深度靶向测序（中值靶向覆盖236x）鉴定了来自141个肿瘤的总共11149个突变。突变谱主要包括T>A和A>T，T>C和A>G，以及C>T和G>A改变，与小鼠食管中的DEN诱变一致。在功能上，大多数突变是蛋白质改变，最常见的是错义单核苷酸变体（SNV）。在两个时间点肿瘤之间的突变类型和突变谱相似。对最大变异等位基因频率（VAF）的分析表明，10日龄肿瘤是高度多克隆的，而一年后存活的大多数肿瘤是单克隆的，结果与通过肿瘤内竞争选择突变体克隆。图3：二乙基亚硝胺（DEN）生成肿瘤的特征。

为了测试突变的选择是否是存活肿瘤的特征，计算了非同义突变（dN/dS）比率-在所有测序基因中肿瘤和正常组织中的稳健选择度量，值超过1表示积极选择。突变Notch1和Trp53在10天时在肿瘤中被阳性选择，而在1年时选择Atp2a2，Notch1，Notch2，Chuk和Adam10。一岁肿瘤的全外显子组测序未检测到任何其他选定的基因。在10日龄和1岁肿瘤之间，每个肿瘤的阳性选择突变基因的数量增加。这主要是由于Atp2a2和Notch1的突变，随着时间的推移，这些突变主导了肿瘤内的克隆选择，在dN/dS值，突变数量和突变基因占据的肿瘤面积估计比例方面表现出最高的增益。Atp2a2的选择是值得注意的，因为该基因杂合的小鼠发展为自发性食管鳞状细胞癌。全外显子组和全基因组测序分析发现，在9,12或18个月收集的持续肿瘤中染色体改变可忽略不计，这表明基因组不稳定性对DEN产生的肿瘤的存活没有实质性贡献。总之，这些结果表明新生肿瘤与一年后持续存在于组织中的肿瘤在遗传上不同，反映了肿瘤内克隆进化和/或整个病变的竞争性选择，这可以决定它们从组织中的存活或消除。图4：肿瘤和邻近正常组织的测序。

接下来试图找出造成早期肿瘤丢失的机制。与之前的观察结果一致，在DEN处理的正常上皮细胞（约0.04%的细胞）中发现可忽略不计的活化的胱天蛋白酶-3阳性凋亡细胞。值得注意的是，在肿瘤内未检测到caspase-3阳性细胞，表明早期肿瘤不会因细胞凋亡而丢失。然后评估肿瘤丢失是否由肿瘤细胞增殖减少引起。对细胞周期S期细胞的5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）分析标记了肿瘤和周围正常上皮细胞中相似比例的细胞。此外测量了转基因Rosa26M2rtTATetO-HGFP小鼠的细胞分裂速率，该小鼠经强力霉素处理后表达稳定的组蛋白-绿色荧光蛋白（HGFP）。一旦强力霉素被撤回，HGFP表达以取决于细胞分裂速率的速率下降。强力霉素停药后不同时间点HGFP表达的测量表明正常细胞和肿瘤细胞以相似的速率分裂。从这些结果得出结论，早期肿瘤不会因肿瘤细胞凋亡或增殖细胞的丧失而丧失。另一种潜在的肿瘤消除机制涉及免疫系统。然而，尽管偶尔观察到免疫（CD45+）细胞与新出现的肿瘤密切接触，但它们的密度和分布模式与周围正常区域没有差异。这表明免疫系统未检测到早期肿瘤。此外，缺乏典型抗肿瘤免疫应答的免疫缺陷型NODCg-PrkdcscidIL2rgtm1Wj1 SzJ小鼠显示出与野生型对照相似的肿瘤形成和丢失率。这些结果表明，免疫系统既不涉及早期肿瘤的发生也不涉及早期肿瘤的消除。图5：早期肿瘤不受肿瘤细胞凋亡、异常增殖或免疫系统的影响。

在DEN处理的正常上皮细胞内，高度竞争性的突变克隆扩增并消除其不太适合的邻近克隆。这使假设新出现的微观肿瘤也可能被周围正常组织中扩展的高度适合的突变克隆所覆盖，导致肿瘤丢失。为了使这种机制可信，竞争性突变体克隆应存在于与早期肿瘤相邻的大部分正常上皮中。因此对10天肿瘤周围的正常上皮进行了超深度靶向外显子组测序（中位目标覆盖率为220×），在81个微活检组织中鉴定了12789个突变，覆盖率约为0.4 mm2。突变效应和突变谱的分布与在10日龄肿瘤中发现的相似。每mm2正常上皮检测到数百个小突变体克隆。dN/dS分析鉴定了3个基因，Notch1，Trp53和Fat1被阳性选择，其中Notch1突变是最常见的，估计存在于约24%至44%的正常细胞中。这种选择模式非常让人联想到老化的人类正常食管。肿瘤和正常上皮的比较分析显示，虽然非同义的Notch1突变体优先在正常组织中富集，但Atp2a2突变体在肿瘤中更普遍，在DEN暴露后一年恶化。因此，与假设一致，这些结果显示强烈的竞争和选择高度适合的突变克隆已经发生在正常食管上皮十天后撤回DEN。数据还表明，不同的选择压力可能作用于正常和肿瘤上皮，影响由此产生的突变景观。接下来研究了在正常上皮中诱导高度适合的突变克隆是否改变了早期肿瘤存活。使用了AhcreERTR26DNM−GFP/wt（MAML-Cre）小鼠，其携带抑制Notch信号的MAML-1（DN-MAML1）的诱导型高竞争性显性失活突变等位基因。DN-MAML1与GFP融合，使表达突变体的克隆能够成像。在DEN处理后10天诱导MAML-Cre小鼠加速肿瘤去除。肿瘤的损失与DN-MAML1突变体克隆占据的上皮面积成比例。由DN-MAML1或五彩纸屑克隆包围的肿瘤图像确定了肿瘤丢失的潜在机制。正常上皮中的突变克隆可能胜过基底层的肿瘤细胞。当肿瘤在该层内的足迹被扩大的正常克隆所取代时，病变将脱落-类似于其他上皮细胞中描述的突变细胞挤出的机制。上述结果与通过与相邻正常上皮中的高度适合的克隆竞争消除肿瘤的模型相容。为了挑战这个假设，调查了肿瘤形成后中和克隆竞争的效果。Notch1失活突变赋予DEN治疗的食管上皮细胞中所有突变基因最强的竞争优势。因此，通过用二苯并氮杂（DBZ）处理小鼠来灭活Notch信号传导，预计会“提高”整个组织的竞争适应性并减少肿瘤损失，因为突变上皮克隆与肿瘤相比没有优势。结果显示DBZ治疗确实减少了肿瘤损失。得出这样的结论：正常上皮中突变克隆的扩增通过竞争去除早期肿瘤，作为对肿瘤存活的选择性压力。图6：通过在相邻正常上皮中扩增突变克隆消除早期肿瘤。

人类受到针对肿瘤的高效先天保护机制的保护，例如免疫系统。这项研究已经确定了一个独立于免疫系统的额外的肿瘤保护机制，通过该机制，存在于正常上皮中的扩展的高度适合的突变克隆胜过并消除早期肿瘤病变。这些在癌发生背景下的研究补充了转基因实验，揭示了野生型细胞在消除不太适合的突变细胞和上皮损伤中的作用。重要的是，结果表明早期肿瘤的存活不仅取决于它们携带的突变，还取决于邻近正常组织的突变情况。这些发现有助于调和看似矛盾的观察结果，即尽管在健康组织中观察到癌症相关突变的负担很大，但癌症发病率相对较低，并表明正常组织中发现的某些突变可能有助于维持体内平衡，在癌症和衰老方面具有明显的意义。

人类是否存在类似的微肿瘤消除机制尚不清楚。但是，与本研究中描述的鼠标模型有相似之处。与小鼠一样，强烈选择的Notch1突变体克隆定植于大多数人类正常食管上皮细胞。此外，在其他健康的人类食道中可见与诱变小鼠模型中描述的表型相似的罕见的小肿瘤。这些发现暗示正常上皮中突变克隆的微肿瘤消除在人类中可能是保守的。这种机制是否在竞争性选择下携带突变克隆的其他人类上皮细胞中起作用，例如皮肤，子宫内膜，肺和结肠，尚需进一步研究。本文结果表明，这不仅被视为癌症的潜在起源，正常上皮中的突变克隆也通过消除新出现的微肿瘤而具有肿瘤抑制作用。操纵正常上皮的突变克隆结构的治疗可能因此在早期癌症预防中起作用。

教授介绍：

Phil H Jones

Phil研究正常干细胞中与癌症相关的DNA变化如何改变其行为，从而使其在正常组织中传播，这是通向癌症的第一步。他的研究重点是改变正常干细胞竞争适应性的突变如何赋予突变干细胞在正常组织中传播的能力。Phil H Jones目前的工作利用深度测序、成像、基因编辑和单细胞分析来确定致癌突变如何改变干细胞在衰老过程中的行为，以及皮肤和食道癌症发展的早期阶段。这些基于实验室的研究补充了Phil H Jones在Addenbrooke医院治疗非黑色素瘤皮肤癌患者的临床工作。Phil H Jones的目标是应用我们的研究开发合理的干预措施，以降低癌症高危患者的癌症风险。

Phil H Jones在1995年获得伦敦大学博士学位，2007年发表《表皮稳态的基础》，2011年成为MRC癌症科项目负责人，2012年出版《食管干细胞》，2014年成为医学科学院院士，2015年出版《正常皮肤的突变》，并加入威康信托桑格研究所，2018年出版《正常食管的突变》。

参考文献：

B. Colom，A. Herms，P. H. Jones et al.Mutant clones in normal epitheliumoutcompete and eliminate emerging tumours[J].Nature | Vol 598 | 21 October2021.