常见的ceRNA网络，不常见的多种类药物分析！
Comprehensive characterization of a drug-resistance-related ceRNA network across 15 anti-cancer drug categories
15类抗癌药物耐药相关ceRNA网络的综合表征
发表期刊：Mol Ther Nucleic Acids
发表日期：2021 Feb 15
影响因子：7.032
DOI: 10.1016/j.omtn.2021.02.011
一、研究背景
癌症是全球第二大死亡原因，据估计，2018年全球癌症新发病例1810万，癌症死亡人数960万。耐药性是指某些类型的癌症对某种或多种药物不敏感，是癌症治疗的关键问题。对现有药物的耐药性的出现是治疗癌症的一大挑战。大多数晚期癌症对传统疗法不敏感。为了确定耐药性的分子机制，已经进行了大量的研究，编码基因和非编码基因在耐药性中的影响已被广泛研究。
近年来，Salmena等人提出了一种新的方法来揭示非编码和编码RNA之间的相互作用，即竞争性内源RNA（ceRNA）理论。ceRNA三者包括lncRNAs、miRNAs和蛋白编码基因（PCGs）。此外，ceRNA机制在耐药中也发挥着重要作用。然而，目前还缺乏关于不同药物类别的全球药物敏感性相关ceRNA网络的了解。
二、材料与方法
1 数据来源
1）miRanda、RNAhybrid、TargetScan和PITA预测miRNA-lncRNA的相互作用
2）数据库TarBase和miRTarBase中获得miRNA-PCG相互作用
3）从CellMiner数据库收集了药物和药物敏感性相关的PCG和miRNAs（抗癌药物根据其作用方式被分为15种药物类别）
4）GSE80332：NCI60癌细胞系面板中的lncRNA表达谱
5）从LncRNADisease下载癌症相关的lncRNAs；癌症相关的PCG是从COSMIC和之前的一项研究中提取的；与癌症相关的miRNAs是从miR2Disease和HMDD收集的。
6）PPI数据来自HPRD和BioGRID，转录因子数据来自TRANSFAC
7）肿瘤和正常组织之间的差异miRNAs是从miRNACancerMap中获得的；从OncoLnc和UALCAN下载了TCGA生存数据和癌症的分子亚型
2 分析流程
流程图
三、结果展示
01 - 15种抗癌药物的ceRNA网络的全球格局和比较
为了研究ceRNA三联体(lncRNAs-miRNAs-PCGs)的作用和药物敏感性相关的ceRNAs的竞争模式，作者构建了跨越15个抗癌药物类别的15个ceRNA网络(图1)。共鉴定出105255个ceRNA相互作用，涉及217个lncRNAs、158个miRNAs和1,389个PCGs。最大的ceRNA网络属于YK，而最小的ceRNA网络属于Df。
图1 15种抗癌药物的ceRNA网络
对15个ceRNA网络进行了KEGG通路分析（图S1）。有些信号通路是所有药物类别共有的，而有些信号通路是药物类型特有的。
图S1 15个ceRNA网络的KEGG富集分析
通过计算Jaccard系数，比较了它们的lncRNAs、miRNAs和PCGs等成分。结果显示，包括lncRNAs和miRNAs在内的ceRNA分子在15个ceRNA网络中较为保守，而miRNAs则倾向于在不同的ceRNA网络中共享（图2A-2C）。相反，PCGs在这些药物类别中显示出最低的相似性（图2C和2D）。lncRNAs、miRNAs和PCGs的Jaccard系数的平均值如图2D所示。然后，比较了lncRNAs、miRNAs和PCGs在所有ceRNA网络中的分布情况（图2E）。结果表明，不同药物类别共享的lncRNAs和miRNAs比PCGs多。
枢纽节点被确定为高度连接的节点，被认为在维护网络稳定性方面起着至关重要的作用。在本研究中，将度数最高的前5%且度数>10的lncRNA和PCG节点定义为枢纽节点。在15个ceRNA网络中共定义了98个枢纽。其中，56个枢纽节点被所有网络共享。这些共享的枢纽节点属于lncRNAs（图2F），此外，还有一些特定的枢纽节点（图2F）。
图2 15个ceRNA网络和中心节点的相似性分析
此外，还研究了这些ceRNA网络中lncRNAs的特性。根据lncRNA注释，确定了15个ceRNA网络中lncRNAs的类别。这些竞争性的lncRNAs大部分被分类为长基因间非编码RNA（lincRNA）、反义和加工转录物（图S4）。
图S4 不同种类的lncRNAs的分布
02 - 15个药物类别的ceRNA与癌症标志过程之间的相关性
接下来，研究了这些ceRNAs在15种药物类别中在癌症中的作用。图3A中显示了富集每个药物类别的lncRNAs、miRNAs和PCGs的竞争三联体。结果表明，介导lncRNA-PCG竞争对的miRNA更可能与癌症有关。
然后，探讨了每个药物类别的这些PCG是否针对癌症标志过程。收集癌症标志过程后，使用Jaccard系数来测量每个ceRNA网络中癌症标志基因和PCG之间的交集。ceRNA网络中的PCGs在广泛的癌症标志中都有体现（图3B）。这些研究结果表明，这些癌症标志往往是不同药物之间共同的，也进一步证实了抗癌药物敏感性相关ceRNAs共同网络的存在，一些基因与多药耐药性相关。
图3 15个药物类别的ceRNA与癌症标志过程之间的相关性
03 - 在15个ceRNA网络中构建ICN并分析其治疗潜力
在15个ceRNA网络中，lncRNAs、miRNAs和PCG有许多交集（图2和3）。这就提出了一个问题，即在15个药物类别的ceRNA网络之间是否存在交集。如果存在，它们的功能是什么？
为了确定这一点，作者提取了15个ceRNA网络的交集边缘，并构建了一个ICN，该ICN由7个lncRNA、13个miRNA和32个PCG组成（图4）。H19是ICN中连接最多的lncRNA节点，可能调控了耐药性的关键信号通路（图4）。
图4 不同药物的交叉ceRNA网络(ICNs)
一些预测的关系已经用HT29和耐甲氨蝶呤的HT29（HT29-MTX）结肠癌细胞系进行了验证。与HT29细胞相比，HIF1A和H19的表达在HT29-MTX细胞中上调（图S6A和S6B）。此外，敲除H19后，HT29-MTX细胞中miR-20a-5p、miR-20b-5p和miR-17-5p上调（图S6C-S6F）。
图S6 交汇点ceRNA网络（ICN）中预测途径的验证
另外，为了验证lncRNA H19/miRNA/HIF1A的ceRNA网络，还进行了另外一个实验。结果显示，miR-17-5p可以直接与H19和HIF1A结合。此外，敲除H19可以上调miR-17-5p，下调HIF1A mRNA和蛋白（HIF-1α）的表达水平，而miR-17-5p的抑制作用可以减弱这一作用（图S7）。
图S7 H19和HIF1A是miR-17-5p的直接靶点
为了显示ICN对药物反应的影响，分析了对76种美国食品和药物管理局（FDA）批准的抗癌药物的药物敏感性与ICN中基因的转录表达之间的相关性（图5）。
图5 药物敏感度与ICN基因之间的关系
04 - CAGs和ICN中的基因之间的相互作用
为了进一步了解ICN的临床意义，将ICN中基因的表达谱与CAGs相关联。CAGs是FDA批准的药物靶点基因和相关的生物标志物基因，包括132个靶点治疗基因和19个免疫治疗基因。获得151个基因的表达谱，并计算出Pearson相关系数（PCC）值（图6）。观察到94.7%的CAGs与ICN中的基因相关，ICN中的基因也与CAGs相关。其中，观察到一些蛋白-蛋白相互作用（PPIs）和转录因子-基因相互作用。这些结果表明，CAGs可以被ceRNAs调控，包括通过靶向治疗和免疫治疗。
图6 ICN中的基因与临床可操作基因(CAGs)之间转录表达的相关性
05 - ICN的临床相关性
然后，作者探讨了ICN中的基因与患者生存时间和癌症阶段的关联。确定了1个lncRNA、13个miRNA和33个PCG与至少一种癌症类型的总生存期相关（图7A）。ICN中的大部分基因与脑低级胶质瘤(LGG)患者的生存率呈负相关，而只有少数基因与急性髓细胞白血病(LAML)患者的生存率有相关性。此外，ICN中的许多基因与肾脏肾脏透明细胞癌（KIRC）、胃腺癌（STAD）和乳腺癌（BRCA）的生存时间和癌症阶段相关。
有些基因作为癌症的促进者或抑制者，与患者的结果密切相关。例如，E2F2表达水平低的患者在头颈部鳞状细胞癌（HNSC）、STAD和直肠腺癌（READ）中的生存率显著降低（图7B）。相反，其他几个基因则促进了癌症的进展。
图7 ICN在21种癌症中的临床相关性
四、结论
综上所述，本研究描绘了15类抗癌药物的ceRNA串联景观。通过系统地分析ceRNA网络，揭示了ceRNA调节的一些重要特性。此外，最近的工作还对小分子药物及其受影响的lncRNA进行了表征，这些发现不仅为抗癌药物耐药性的研究提供了新的启示，也为临床合理用药提供了新的启示。
