题目：Immune cell profiling of COVID-19 patients in the recovery stage by single-cell sequencing
发表期刊：Cell Discovery(IF:10.8)
发表年份：2021-05-04

摘要

背景：COVID-2019冠状病毒的关键免疫细胞亚群变化及其状态尚不清楚。
方法：在COVID-19患者早期恢复期阶段(early recovery stage (ERS))，采用单细胞组学技术，对病人的外周血单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cells) 进行转录组测序并分析。
结果：COVID-19患者ERS阶段，T细胞明显减少，而单核细胞增多。具体来说，在ERS阶段，炎症相关基因表达的经典CD14++单核细胞比例增加，CD14+IL1β+单核细胞的比例也是如此。而CD4+T细胞和CD8+T细胞显著减少，并且其炎症相关基因表达量较高。在B细胞中，浆细胞显著增加，而naive B细胞减少。

实验设计及质控

样本来源：15个样本，包括5个早期恢复阶段(ERS, early recovery stage)的COVID-19病人，5个晚期恢复阶段(LRS, late recovery stage)的COVID-19病人和5个健康对照组(HC, healthy control)的外周血标本。
那么是如何定义ERS和LRS的呢？在mehods有提到，ERS组病人定义为检出该病人第1次核酸阳性后，其后续转阴时间少于7天。LRS定义为定义为该病人第1次核酸阳性后，其后续转阴时间超过14天。
标本处理：15个外周血标本，经过密度离心后，提取单个核细胞。每个样本的细胞存活率都大于80%。
细胞过滤标准： gene number between 200 and 7000。过滤后，剩下128096个细胞(13092/10035/13624/8329/12158 cells for HCs; 5163/7685/7171/10058/6581 cells for ERS; 3242/7895/7487/7164/8412 cells for LRS) 进入下游分析。

结果

1.总体免疫细胞表达谱

先聚类注释，根据经典marker, 初分为髓系细胞、B细胞，NK细胞和T细胞，3种大类细胞(Figure 1c-d)。 Figure 1c
Figure 1d

2.COV2019患者血液中NK和T细胞、B细胞、髓系细胞表达谱

接着分析128096个细胞，包括15个样本的36442个髓系细胞、64247个NK和T细胞，以及10177个B细胞(Figure 2a)。 Figure 2a 发现COVID-19患者中，ERS和LRS的患者，髓系细胞比例高于HCS，但NK和T细胞比例较低(Figure 2c-d)。LRS患者的B细胞、NK细胞和T细胞比例比ERS患者多，但髓样细胞较少。结论是COVID-19患者患者淋巴细胞计数减少，外周血中髓系细胞计数增加。 Figure 2c-d 接着对HCs和COVID-19患者的NK和T、B细胞、髓系细胞的基因进行差异分析，发现COVID-19患者的NK&T和B细胞中的炎症细胞因子和趋化因子基因，例如IL1B、CCL3、IRF1、DUSP1、JUN和FOS高水平表达，而髓样细胞未观察到这种差异(Figure 2d-f)。 Figure 2d-f

3.恢复期COVID-19患者的髓系细胞亚群及其状态变化

将髓系细胞分为6群：Classical CD14++ monocytes (M1), non-classical CD16++ (FCGR3A) CD14−/+ monocytes (M2), intermediate CD14++ CD16+ monocytes (M3), CD1C+ cDC2 (M4), CLEC9A+ cDC1 (M5), and pDC (CLEC4C+CD123+) (M6) (Figure 3a-b)。 Figure 3a-b 他们发现，在髓系细胞中，与HSs对比，ERS患者的Classical CD14++ monocytes （M1）比例较高于HCs患者，而LRS患者则未见差异(Figure 3c). Figure 3c 与HCs对比，患者的CD14++IL1β+单核细胞和IFN活化单核细胞的丰度较大。与HCs对比，COVID-19患者的CD14++ inflammatory monocytes (M1) 表达较高水平的inflammatory基因，如IL1β、JUN、FOS、JUNB和KLF6和趋化因子、CCL4、CXCR4，还有干扰素刺激基因IFRD1、IRF1和FI6。相反，COVID-19患者的 CD14++ monocytes (M1) 中的anti-inflammatory基因则低表达(Figure 3d-e)。 Figure 3d-e 值得注意的是，IL1β在ERS组中上调，在LRS组下调(Figure 3f)。这些结果提示，在COVID-19患者中，细胞因子激活驱动了单核细胞群扩增（尤其是 CD14++ inflammatory monocytes cell) Figure 3f
COVID-19患者的CD14+单核细胞，上调的基因主要富集在细胞因子信号传导和炎症激活相关的通路，这些通路主要参与基因是IFITM3，IFI6，IL1β、JUN、FOS、JUNB和KLF6(Figure 3g)。总的来说，这些发现表明ERS患者单核细胞群的平衡失调表现为Classical CD14++ monocytes (M1)显著增加。在SARS-CoV-2感染期间，Classical CD14++ monocytes (M1)在外周循环中增加，从而加剧炎症。 Figure 3g

4.COVID-19患者外周血T细胞和NK细胞的特征

T and NK lymphocytes可被分为10个亚群(Figure 4a-b)。 Fe 4a-b T&NK细胞亚群组成在HSc和COVID-19两组中，有明显差异(Figure 4c)。总的来说，COVID-19患者中CD8+T细胞(尤其是effector memory CD8+ T cell)和NK细胞的数量减少，但ERS患者的NK细胞相对比例高于HCS。CD4+T细胞总体比例变化不大，COVID-19患者中central memory CD4+ T cell比例明显较高，而naïve CD4+ T cells, Tregs and effector memory CD4+ T cell比例较低，这种现在是ERS组更明显。 Figure 4c COVID-19患者中的 CD4+ T cells有较高水平的inflammation-related genes。ERS组病人中，表达较高的FOS, JUN, KLF6, and S100A8。COVID-19患者的CD4+T细胞中，anti-inflammatory则下调(Figure 4d-e)。这表明CD4+T细胞是病毒感染的主要参与者。 Figure 4d-e
COVID-19患者的CD4+T细胞中，上调基因富集通路中，含有较多细胞因子途径和炎症激活相关的基因，包括IFITM3和IFI6、IL1B、JUN、FOS、JUNB和KLF6(Figure 4f)。 Figure 4f

接着做了TCR-seq 分析。TCR-seq分析显示，ERS组的T细胞扩增水平明显低于HC组(Figure 4g).此外，naïve or central memory T细胞几乎没有克隆性扩增，而effector memory T cells, terminal effector CD8+ T cells (CTLs), and proliferating T cells的扩增水平更高。此外，与HCs相比，扩增克隆的CD8+CTL也表现出过度激活的炎症和抗病毒活性(Figure 4h-i)。

Figure 4g

5.COVID-19患者外周血B细胞的特征

B细胞可分为4群，naïve B cells，memory B cells， immature B cells 和 plasma cells(Figure 5a-b)。 Figure 5a-b 与HCs患者相比，COVID-19患者浆细胞比例显著较高，naïve B cells比例下降(Figure 5c)。Memory B cells and plasma cells (MPB)协同并诱导特异性抗体产生， 可能在控制病毒感染和适应性免疫中发挥重要作用。B细胞活化相关基因，例如S100A8、IGLL5、SSR3、IGHA1、XBP1和MZB1，主要表达在ERS组的MPB中(Figure 5d)。接着将COVID-19患者的每个B细胞亚群的炎症基因的平均值与HCs组进行比较(Figure 5e)，显示COVID-19患者的B细胞反应和抗体分泌功能增强。 Figure 5c-e COVID-19患者的B细胞增殖能力和病毒转录水平增强，表现为HAG1、XBP1、MZB1、Jun、POLR2L和ZFP36表达增高(Figure 5f)。与HCs相比，COVID-19患者IgA同种型的表达量过多(Figure 5g)。这与血清中IgA水平升高相对应此外，ERS患者（IgA+IgG+IgE）与（IgD+IgM）的比率显著增加，并随着恢复时间呈下降趋势(Figure 5h). Figure 5f-h
最后做了个BCR，发现memory B cells几乎没有克隆扩增，而CD27+CD38+ memory B cells在不同的B细胞亚群中表现出最高的扩增水平(Figure 6a).与HCs比，Covid-19患者的细胞克隆扩增较多，提示SARS COV-2感染下B细胞经历独特的VDJ重排。与LRS患者相比，ERS患者的B细胞克隆扩增较高(Figure 6b)。此外，对每个个体来说，ERS组中最大克隆的比率高于HCs组(Figure 6c)。 Figure 6a-c 为了解发生克隆扩增的B细胞的功能状态，将克隆记忆B细胞和其他B细胞之间进行了差异基因分析。结果显示，克隆扩增的B细胞基因表达增加，包括CD27、SSR4、IGHG1、MZB1和XBP1。随着病程的推移，LRS患者中扩增B细胞的差异基因数目显著减少（Figure 6d）。 Figure 6d 接着发现与HCs比，Covid-19患者的IGHV3家族基因过度表达，尤其是IGV3-7、IGV3-15、IGV3-21、IGV3-23和IGV3-30（Figure 6e） Figure 6e ERS患者配对频率较高的是IGHV3-23-IGHJ4和IGHV3-7-IGHJ6(Figure 6f)。 Figure 6f

Covid-19患者免疫细胞的细胞通讯

B细胞-单核细胞和B细胞-T细胞的相互作用提示B细胞可以分泌大量IL-6、LTA和LTB，它们与单核细胞中表达的IL-6R、LTAR和LTBR结合，并将大量IL-6作用于T细胞，并促进IFN-γ、IL-1β和其他炎性细胞因子和趋化因子的分泌。因此，ERS组患者中，高表达IL-6的炎性单核细胞及其子代形成级联信号(Figure 7c)。在LRS中，DC产生IL-18、TNFSF13和TNFSF13B，以促进B细胞的增殖，向血液中分泌许多抗体。从DC-T和T细胞-B细胞的相互作用中，发现DC不仅产生IL-18，还产生IL-7以促进T细胞的增殖；此外，T细胞产生IL-2以促进B细胞的增殖和抗体产生(Figure 7d)。 Figure 7c-d

讨论

关于讨论比较长，我挑了一些简单的讲。
1.文中发现ERS患者中出现了炎症反应，这也许可以解释为什么一些患者在出院后生病，并建议应该重新评估目前的出院标准。
2.文中发现几个COVID-19感染特有的位点，配对频率最高的是IGHV3-23-IGHJ4，这尚未被报道过。目前已有多个类似的位点与病毒相关，例如IGHV3-30 和 IGKV3-11可参与编码一抗中和人巨细胞病毒。IGHV3-30和IGHV3-21已被用于分离流感病毒抗体，并用于生产病毒疫苗。此外，结合 IGHV3-15/IGLV1-40 片段的抗体对埃博拉病毒具有很好的中和活性。

结论

总之，该研究提供了第一份COVID2019患者康复出院后出现适应性免疫失调现象的免疫细胞图谱，对较大队列中康复患者的纵向研究可能有助于了解疾病的后果。本研究下确定的新BCR可能会促进我们对B细胞机制的理解，并在COVID-19免疫疗法中具有潜在的临床应用。