化合物纯度、溶剂溶解度检测 | MedChemExpress
产品检测方法一般有核磁共振氢谱(HNMR),液质联用 (LCMS),高效液相色谱 (HPLC)。我们一般通过核磁共振确定结构式 (产品是否正确) 和大概纯度 (是否含杂质及杂质大概比例),通过 LCMS 或 HPLC 测定确定产品具体纯度 (产品需要有紫外吸收)。
■ 核磁共振(NMR)
核磁共振(Nuclear magnetic resonance),简称 NMR,是磁矩不为零的原子核,在外磁场作用下自旋能级发生塞曼分裂 (Zeeman effect),共振吸收某一定频率的射频辐射的物理过程。核磁共振波谱学是光谱学的一个分支,其共振频率在射频波段,相应的跃迁是核自旋在核塞曼能级上的跃迁。主要用于鉴定分子的结构,样品的纯度。
NMR常用的溶剂:一些小极性的化合物(脂肪长链的,脂肪环的) 一般用chloroform做溶剂,甾体类的化合物多用氘代吡啶做溶剂。核磁检测常用氘代溶剂有:D2O,氘代丙酮,氘代 DMSO,Chloroform-d,氘代甲醇,氘代苯,氘代乙*,氘代吡啶等。我们的产品中一些盐、大极性的化合物可以选用氘代 DMSO,重水,氘代甲醇做溶剂。
核磁共振氢谱(HNMR):HNMR是用来测定分子中 H 原子种类和个数比的。HNMR 中,峰的数量就是 H 的化学环境 (即 H 的种类) 的数量,而峰的相对高度,就是对应的处于某种化学环境中的 H 原子的数量,不同化学环境中的 H,其峰的位置是不同的。例:CH3CH2OH中,有 3 种 H,则有 3 个峰,强度比为:3:2:1。CH3OCH3中,只有一种H,则有 1 个峰。CH2=CH-CH3中,有三种H,个数比为:2:1:3。
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核磁氢谱谱图解析:
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1、产品结构式,分子式及分子量,通过分子式判断 H 原子总数;
2、H 原子化学位移,体现的是 H 原子种类,化学位移单位为 ppm;
3、样品检测用的氘代试剂溶剂峰;
4、氘代试剂中的水峰;
5、不同化学位移情况下 H 原子个数分布,个数总和与结构式中化学式中 H 原子个数 12H 一致,化学位移 11.05 ppm 为活泼 H,积分值可能不足 1;
6、谱图右侧为检测参数,包括仪器信息,检测温度,扫描次数等。
■ LCMS 检测
质谱(MS) 是用电场和磁场将运动的离子 (带电荷的原子、分子或分子碎片,有分子离子、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子) 按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。质谱是纯物质鉴定的最有力工具之一,其中包括相对分子量测定、化学式的确定及结构鉴定等,具有灵敏度高,样品用量少,分析速度快,分离和鉴定同时进行等优点。
质谱一般与高效液相色谱(HPLC) 或气相色谱 (GC) 联用,对样品组分分离,分别测定各组分的分子量与百分比。与高效液相色谱 (HPLC) 联用,称为 LCMS (Liquid chromatography-mass spectrometry)。
LCMS 谱图分析 (高效液相 HPLC 与质谱 MS 联用):
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1、LCMS 第一/二个曲线图,为检测器 DAD 紫外吸收高效液相 HPLC 图,检测波长一般是 214 nm/254 nm,可作为纯度参考;
2、第三个曲线图,为 MS 信号流,显示 MS 信号强弱,可能因信号噪音出现基线不平现象,不作为纯度参考;
3、第四个曲线图,为提取的含目标产品 MS 信号图,有出峰表示有目标产品,无出峰表示无目标产品;
4、MS 质谱图,MS 信号显示目标分子量 M+1 峰,或 M+Na 峰,以及电离产生的碎片离子峰。
质谱MS 分析:横坐标是质荷比,即离子的质量和质子所带的电荷之比。纵坐标是离子流的强度,最高峰为基峰。
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1、一般 MS 图谱中的分子离子峰的值应为 EM+1 (Exact Mass),即 [M+H]+,例如醚、酯,胺、酰胺、*化物、氨基酸酯等;
2、常见的加合离子有 [M+Na]+,[M+K]+,[2M+H]+,[2M+Na]+,[M+H]/2+ 等;
3、加有缓冲溶液或溶剂的体系还可引进 [M+X+H]+,(X=溶剂或缓冲溶液中的阳离子) 如:用碱性体系方法分析时常见的加合离子有 [M+NH4]+ (如碱性体系用的铵盐缓冲溶液);
4、负离子检测时,一般 MS 图谱中的分子离子峰的值应为 EM-1 (Exact Mass),即 [M-H]-;加有缓冲溶液或溶剂的体系还可引进[M+X-H]-,(X=溶剂或缓冲溶液中的阴离子)。
■ 高效液相色谱HPLC
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 又称“高压液相色谱”、“高速液相色谱”、“高分离度液相色谱”、“近代柱色谱”等。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支,以液体为流动相,采用高压输液系统,将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱,在柱内各成分被分离后,进入检测器进行检测,从而实现对试样的分析。
根据流动相和固定相相对极性不同,液相色谱分为正相色谱(NP-HPLC) 和反相色谱 (RP-HPLC)。RP-HPLC,可分离产品与杂质,一般用于纯度测定。NP-HPLC 是采用极性固定相 (如带有二醇基、氨基、和*基的固定相及硅胶、三氧化二铝等)、非极性流动相 (如正己烷等) 的分离方法。这是一种根据分子的极性大小将其分开的液相色谱技术。我们一般用于手性异构体的纯度测定,如 ee (enantiomeric excess) 值和 de (Diastereomeric excesses) 值,也就是手性 HPLC。手性 HPLC 检测需要对映异构体,消旋体,或非对映异构体进行定位对照检测。
反相RP-HPLC
一般作为纯度检测:黑色曲线为空白对照,蓝色曲线为样品检测液相图,Rel.Area (相对峰面积) 为纯度。
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正相NP-HPLC
一般用于手性纯度,ee 值或 de 值检测。
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以上是我们常规的检测方法。针对不同的产品,我们根据结构性质来选择合适的方法,包括是否有紫外吸收,是否含手性中心,不同溶剂溶解性如何等等。部分产品如金属络合物、聚合物、无机盐等不适合以上常规方法检测,可以参考相关文献测定红外、紫外吸光度、滴定或者选择其它检测方式