TIME评分系统作为新型评估模型，有助于肺癌预后和治疗策略的选择

New evaluation of the tumor immune microenvironment of non-small cell lung cancer and its association with prognosis

非小细胞肺癌肿瘤免疫微环境的新评价及其与预后的关系

发表期刊：J Immunother Cancer

发表日期：2022 Apr 5

doi: 10.1136/jitc-2021-003765

杂志相关信息

一、背景

        肺癌仍然是全球癌症死亡的主要原因。尽管在手术、化疗、放疗和靶向治疗方面取得了巨大进步，但5年的存活率仍不到50%。免疫检查点抑制剂（ICI）的最新发展彻底改变了肺癌的治疗，但仍然只有少数患者对单药治疗或联合疗法有反应。因此我们需要更好地了解肿瘤免疫微环境（TIME），以促进预后和预测生物标志物的鉴定，并为肺癌患者制定更有效的治疗策略。

        不久前，Galon等人提出了基于“免疫环境”概念的肿瘤免疫系统状态评估。这是对TIME中免疫细胞类型的评估，称为“Immunoscore”，对原位T细胞浸润进行量化，从而纳入了宿主免疫反应的影响。它已在结直肠癌中得到国际验证，并且比当前基于肿瘤的肿瘤淋巴结转移（TNM）分期系统提供更好的预后信息，能有益于癌症分类和提高预后准确性，也适用于其他癌症类型。

二、材料和方法

1.数据来源

1）.113例肺癌患者的肿瘤样本

2）.肺癌患者TCGA数据集

3）.ICI治疗的黑色素瘤患者数据集 (GSE78220, GSE91061)

2.分析流程

1）.样本DNA、RNA提取

2）.全外显子组测序WES(n=95)和RNA测序 (n=113)

3）.TIME评分：为评估TIME中癌细胞、免疫细胞和局部免疫抑制元件之间的复杂相互作用，基于肿瘤增殖、抗肿瘤免疫和免疫抑制三个主要因素的新评分系统。TIME的状态可以通过与肿瘤增殖（T-因子）、抗肿瘤免疫（I-因子）和免疫抑制（S-因子）相关的因素来描述，在分子特征数据库（MsigDB V.7.1）或之前验证和报告的基因集中，选择与这些因素相关的九个代表性基因集。

4）.对来自RNA-seq的TIME中不同细胞类型进行量化和去卷积【xCell 、quanTIseq 、 CIBERSORT 】

5）.使用HLA分型软件Omixon target HLA（Omixon）：从正常基因组DNA的WES数据确定HLA分型和HLA I类表位结合预测HLA类型。使用Neoantimon评估来自单个HLA等位基因错义突变的预测候选新抗原。计算得到新抗原肽IC50<500 nmol/L和相应的野生型肽IC50>500 nmol/L为预测新抗原表位。将能够产生一个或多个HLA-A、HLA-B或HLA-C限制性新表位的错义突变定义为预测新抗原（p-neoAg）。使用bam-readcount评估了RNA表达数据，并计算了p-neoAgs中表达的新抗原表位（e-neoAgs）的数量。

6）.流式细胞术

7）.肿瘤浸润淋巴细胞扩增和ELISA

8）.统计分析

三、实验结果

1.TIME评分与临床特征、流式细胞术和基因表达数据的相关性

        对来自113个肿瘤患者的RNA-seq进行富集分析，将与有丝分裂和糖酵解相关的基因集的z-score分配给肿瘤因子（T-scores），T细胞和B细胞以及MHC蛋白复合物被分配到抗肿瘤免疫因子（I-scores），最后，将抑制炎症细胞因子产生、血管生成、缺氧和EMT分配给免疫抑制因子（S-scores）（图1A）。T-scores和I-scores呈负相关，而I-scores和S-scores呈正相关（图1C）。

        接下来，作者研究了每个TIME分数与临床病理特征或流式细胞术和基因表达之间的关联。T评分与病理分期、组织学分级、浸润性病变大小以及FDG-PET的最大标准摄取值呈正相关(图1D)；I评分与流式细胞术检测的肿瘤组织FTD中CD3+细胞和CD19+细胞的比例相关，根据GZMA和PRF1的mRNA的表达水平估计，I评分也与细胞溶解活性（CYT）相关，后者与细胞毒性T细胞浸润和活性相关 (图1E)；S评分与FAP阳性细胞的频率（与CAFs相关）以及流式细胞术检测CD31+内皮细胞的频率相关（图1F）。 S评分还与从xCell推断的M2巨噬细胞、基质细胞和内皮细胞的丰度以及抗炎细胞因子基因（TGFB1和IL-10）和免疫检查点分子基因（CTLA4、PDCD1（PD-1）、HAVCR2（Tim-3）和LAG3）的表达相关。以上数据表明：基于TIME的T-scores,I-scores, 和S-scores与实验数据一致，可能反映肺癌患者的临床特征。

图1    使用 RNA 测序数据的 TIME 评分以及与肺癌患者临床特征和实验数据的关联。

2.根据 TIME 评分的代表性组织学和驱动突变的分布情况

        为研究T因子、I因子和S因子之间的动态相互作用 ，作者将113名肺癌患者根据T-scores（T）、I-scores（I）和S-scores（S）的高低被分为八组，第一组（G1），Tlo/Ilo/Shi；第二组（G2），Tlo/Ilo/Slo；第三组（G3），Tlo/Ihi/Shi；以及第4组（G4），Tlo/Ihi/Slo；第5组（G5），Thi/Ilo/Shi；第6组（G6），Thi/Ilo/Slo；第七组（G7），Thi/Ihi/Shi；第8组（G8），Thi/Ihi/Slo。所有八组中每个基因组的热图按Z-score和临床数据归一化后显示在图2A。G1-4组（Tlo：82.5%）的腺癌发生率高于G5-8组（Thi51.8%）（图2B左）。相比之下，Thi组的鳞状细胞癌（30.4%）多于Tlo组（10.5%）。然而，根据Ilo和Ihi或Slo和Shi状态，这些组织类型的频率没有显著差异（图2B中右）。接下来，基于WES数据（图2C）和靶向测序数据研究了复发性驱动突变。 表皮生长因子受体（EGFR）突变在Tlo组比Thi组更常见（图2D左），Thi组的TP53突变频率高于Tlo组。然而，在Ilo组和Ihi组之间，或Slo组和Shi组之间，EGFR或TP53的突变频率也没有差异（图2D中右图）。

图2    组织学和突变分析以及TIME评分。

        与野生型EGFR相比，EGFR突变型肺癌的T评分显著更低（图S2A），但TP53突变型肺癌的T评分显著更高，TP53突变型肺癌的I评分显著更低（图S2B）。

图S2    突变与TIME评分的相关性。

3.单核苷酸变异、新抗原和免疫选择压力 

        突变衍生的新抗原被认为是抗肿瘤免疫反应和免疫编辑的关键靶点。因此，作者接下来研究了八组患者中单核苷酸突变（SNV）、p-neoAgs和e-neoAgs的数量（图3A-C）。Thi组SNV和p-neoAgs的数量高于Tlo组（图S3-1A，B），然而，两组之间的e- neoAgs数量没有显著差异（图S3-1C）。

        免疫选择压力可能会通过抑制含有新抗原的转录本，消除 e-neoAgs 或影响新抗原表达的肿瘤亚克隆。已经有研究表明，某些免疫原性癌症在肿瘤的全部突变中表现出优先消耗新抗原突变。为了测试这一点是否适用于肺癌亚组，作者比较了观察到的新抗原与预测的新抗原的比率以及每个体细胞突变的新抗原比率。然而，各组之间没有显著差异（图S3-2A-D和图3D）。

        接下来比较了e-neoAgs和p-neoAgs的比率，将其称为“新生抗原表达比率”（图3E）。 尽管Thi组的这一比例略高于Tlo组（图S3-2E），但在该分析中，I评分状态显示Thi/Ihi组（G7,8）的比例显著低于Thi/Ilo组（G5,6）（图S3-2F）。相比之下，Tlo/Ihi（G3,4）组的这一比例并不低于Tlo/Ilo（G1,2）组。这些结果表明，针对新抗原mRNA表达的免疫选择压力可能只发生在新抗原负荷高的Thi组（G5-8），而在Thi/Ilo组（G5,6）中可能会减弱。

图3    新抗原、免疫反应和免疫编辑 图S3-1     比较Tlo（G1-4）和Thi（G5-8）之间的SNV和新抗原。 图S3-2    图3的亚组分析

        作者主要关注针对新抗原的免疫选择压力可能最强的Thi（G5-8）群体。Thi/Ilo组（G5,6）的CYT评分和IFN-γmRNA低于Thi/Ihi组（G7,8）（图3F和G,图S8G，H）。由IFN-γ诱导的 MHC I类和PD- L1的表达模式与IFN-γ表达模式相似（图3H-J）。未观察到MHC I类表达与NK细胞评分在“missing self”识别中的负相关（图3K）。接下来研究了用自体肿瘤细胞攻击的培养 TIL 产生的 IFN-γ，Ilo组（G5,6）的IFN-γ浓度倾向于低于Ihi组（G7,8），但这种差异无统计学意义（图3N）。

        总之，TIL 的数量有限和可能耗尽以及肿瘤 MHC I 类表达降低可能会限制Thi/Ilo G5 和 G6 组针对新抗原的免疫选择。Thi/Ilo/Shi G5 组中最低的免疫反应可能归因于额外的免疫抑制机制。

4.TCGA队列中肺癌的TIME评分及其与生存率的关系

        接下来，作者研究了TIME评分对预后的影响。利用TCGA队列，从990例肺癌患者中获得长期随访数据，而不考虑一些临床特征如组织学的差异。进行了与ACC队列相同的分析（图S4）。

图S4     TCGA队列中的TIME得分和热图

        如图4A所示，OS表明T-scores、I-scores和S-scores是重要的预后因素。此外，根据年龄、性别、病理分期和组织学调整的Cox比例风险模型表明Thi和Shi是独立的不利预后因素，Ihi是独立的有利预后因素（Cox比例风险模型，图4B ）。八组患者的OS明显不同（图4C），其中Thi/Ilo/Shi G5组预后最差，而Tlo/Ihi/Slo（G4）组预后最好。由于Tlo（G1-4）和Thi（G5-8）之间的免疫压力水平不同，接下来进行亚组分析，发现所有Tlo组之间的OS相似。然而，Thi组之间存在统计学上的显著差异（图4D）主要是由于S评分而非I评分（图S11）。因此，与G6（Thi/Ilo/Slo）或G8（Thi/Ihi/Slo）相比，G5（Thi/Ilo/Shi）患者的预后较差（分别为p=0.005和p=0.035），但与G7（Thi/Ihi/Shi）患者的预后较差（p=0.22）。这些结果表明，免疫抑制更可能影响所有Thi组（G5-8）患者的预后。

图4    TCGA队列中TIME评分的预后影响

        最后，作者将TIME评分与之前报道的其他预后评分或因素进行了比较。TIME评分OS预测的受试者-操作者特征（ROC）优于CYT、TIS（肿瘤炎症评分）、微环境评分（xCell）或免疫核心评分（xCell），但与传统TNM分类相当，但并不优于传统TNM分类（图4E）。

5.肺癌的致癌信号通路、TIME评分和预后

        众所周知，肿瘤发生的共同驱动因素调节肿瘤免疫环境。因此，作者根据Sanchez-Vega的方法评估了致癌信号通路的改变，并研究了与肺癌T-scores、I-scores和s-scores的相关性。如图5A所示，与Tlo组相比，Thi组（p53、RTK-RAS和PI3K）中与致癌信号通路有关的基因突变率更高；相比之下，Ilo组的突变率更高（p53、RTK-RAS、PI3K和WNT）；S评分的高低没有差异。因此，在有这些改变的组中，T-scores显著较高，I-scores显著较低（图5B）。同时作者还研究了通路改变对肺癌患者预后的影响，仅PIK3通路改变的肿瘤患者预后不良（图5C）。这些结果表明，PI3K通路的改变与肺癌患者的不良预后相关，与较高的T-scores和较低的I-scores一致。

图5    肺癌的致癌途径、肿瘤免疫微环境评分和预后

6.TIME分数预测ICI反应的可能性

        作者试图测试TIME评分是否能预测ICI的反应，但没有合适的ICI治疗肺癌患者队列。但是不同癌症的TIME评分显示肺癌和黑色素瘤具有相似的T-scores、I-scores和S-scores以及基于此的类似预后，因此利用了76名接受ICI治疗的黑色素瘤患者的数据集（GSE78220，GSE91061）。76例病例的热图如图6A所示。虽然Thi/Ilo/Shi组（G5）的疾病控制率往往低于G4、G6或G7组（图6C），但OS组之间没有显著差异（图6B）。

        最后，研究了TIME评分是否能预测客观反应率（ORRs），生成了TIME评分的ROC曲线。结果TIME评分的曲线下面积（AUC）往往高于TIS或CD274表达（图6D）。两组的Kaplan-Meier生存曲线（使用ORR预测性的最佳截止水平的高分与低分）显示，TIME高分组的患者生存率更高，但TIS或PD-L1表达没有信息（图6E）。

图6    免疫检查点抑制的TIME评分和疗效预测

四、结论

        作者基于与肺癌预后相关的TIME因素开发了一种新的评估模型。TIME评分可以获取肿瘤增殖，抗肿瘤免疫和免疫抑制之间的复杂相互作用，同时由于本研究中使用的大量WES和RNA-seq数据可以从小型活检样本中生成，因此该评分系统可能有助于评估个体患者和肿瘤时间的纵向变化，以进一步预测肺癌患者的预后或选择治疗策略。