肿瘤靶向治疗新方向--合成致死

1946年，Theodosius Dobzhansky发现并命名了“合成致死”效应。这个概念沉寂了51年后。1997年，在相关研究发现癌细胞携带有大量基因突变之后，福瑞德·哈金森癌症研究中心的Stephen Friend敏锐地察觉到，这个“合成致死”的理念或许可以用到癌症的治疗中。

如今，癌症靶向治疗成为精准医疗的必然趋势，但靶向治疗的目标主要集中在癌症突变的基因和通路上，这严重限制了药物靶标的种类。利用了合成致死性这样一种概念，即癌症基因突变的存在通常与一种可以靶向治疗的新脆弱性有关，可以帮助我们极大地扩展潜在癌症药物靶点的武器库。生物信息学以及实验还可以用来确定合成致命的相互作用。以此来进一步发现新的药物靶标。生信分析意向咨询

合成致死性

导致癌症发展的突变同时也会带来可以用于治疗的弱点，癌症的药物治疗也是依赖于这样一种观念。大规模的癌症基因组测序工作已经对各种癌症类型的突变进行了分类，可以借此对癌症的脆弱性进行探索。这些基因改变包括功能获得突变(基因扩增、易位或突变)和功能丧失突变(基因功能因误义突变或缺失而受损)。

功能获得性突变一直是癌症攻克中在开发靶向癌症药物时高度关注的主题。已经开发了一些针对被激活的突变驱动癌基因的癌症药物，如HER2、BCR-ABL、EGFR和BRAF 。这些药物针对的是因致癌突变而异常激活的信号蛋白。这种对致癌驱动通路的依赖的治疗方法通常被称为致癌基因依赖。

从药物研发的角度来看，功能突变的缺失更难处理，对于许多已被证明无法用药的癌基因来说也是如此，如MYC转录因子和RAS蛋白。因此，需要采取替代策略来针对这些类型的致癌基因引起的脆弱性。合成致死率则提供了为间接非药物作用靶点施药的可能。

合成致死性指的是一种遗传原理，即两种基因干扰的组合是致命的，而单独的每一种都不是。

在进化过程中，细胞信号中出现了许多反馈回路，以在细胞外环境发生变化时维持细胞内稳态。当一个基因被抑制时，由于另一个基因可以在功能上补偿或替代它，信号传递中的这种补偿保证了细胞能够存活。然而，抑制这些代偿基因可能会在第一个基因突变时特异性地诱导细胞死亡，而不会影响缺这种突变的细胞的生长。同样，当一个信号通路的抑制导致介导生存的第二个通路的激活时，同时抑制这两个通路可由于合成致死相互作用而导致细胞死亡。生信分析意向咨询

目前还不清楚人类细胞中存在多少人工合成的致命基因对。在标准培养条件下，大约2000个基因对人类细胞存亡至关重要。

在抗癌药物开发的背景下，合成致死性有两个重要方面。

（1）首先，带有致癌驱动基因突变的合成致死基因不一定会在癌症中发生突变。因此，肿瘤细胞中合成致死相互作用的开发可能会显著增加肿瘤药物靶点的数量。失去肿瘤抑制基因的细胞可能会对另一种可能不是致癌基因的基因产生更大的依赖，这种现象被称为非致癌基因依赖。

（2）其次，当与第一种药物合成致死的第二种药物联合使用时，相比作为单一药物，其临床活性的药物效果可以大大增强。研究人员讨论应用合成致死性的概念，以发展新的(和组合)癌症治疗。

研究合成致死率的细胞模型

在这种基因筛选中，可以使用所谓的“等基因细胞系”，即只在单一突变上有差异的细胞对，来寻找那些失活只杀死突变细胞的基因。

另一种方法是，通过恢复具有突变基因的细胞的正常基因功能，为合成致死率筛选一个等基因细胞对。

识别合成致命性的工具

致死相互作用的实验测定是基于识别基因，在失活后，在特定的基因型背景下显示致死表型。有很多方法识别基因型，可以干扰单个基因的表达，或可用于大规模筛选。其中包括：

短干扰rna (sirna)库、短发夹rna (shRNAs)库，以及最近用于Crispr/Cas9基因组编辑的大量引导rna (gRNAs)库。

所有这些技术都可以应用于高通量筛选模式，既可以用在单个池中分析每个基因或每个试剂，也可以应用于混合模式，即数千个载体组合在一个池中。

汇集筛选：定量地比较了长时间培养前后人群中个体shrna或gRNAs的相对丰度，无论是否存在(药物)选择。那些针对基因的shrna或gRNAs在失活后都会导致致命表型将从种群中消失。

通过高通量测序可以确定每个个体shRNA或gRNA的丰度，并可以确定不同种群之间的变化或损耗。

联合筛选的优点是可以相对容易地筛选大量的shrna或gRNAs。这一点很重要，因为每个基因需要多个shRNA或gRNA，因为每个shRNA或gRNA的基因失活效率差异很大，与特定序列相关的脱靶效应可能会导致假阳性。因此，根据给定基因的多个不同shrna或gRNAs的行为选择基因作为命中点是很重要的。

此外，有人可能认为shrna介导的敲除会更接近于药物的效果，因为大多数药物不会完全和持续地抑制它们的靶标。将这些基因视为有吸引力的治疗靶点是否现实，仍是一个悬而未决的问题。重要的是要强调，shrna也可以有显著的脱靶效应，使筛选结果的解释复杂化。

这个问题的一个潜在解决方案是通过使用CRISPR干扰(或CRISPRi)来创造一个最小脱靶效应的击倒。这个方法利用催化失活性突变体CAS9 (dCAS9)融合到KRAB转录抑制域，并结合针对特定基因启动子区域的gRNAs。CRISPRi也可以被设计成dCas9或gRNA的诱导表达。这种方法有利于筛选中必要基因的识别，因为在筛选时可以诱导基因敲除。

在肿瘤抑制基因的情况下，合成致死相互作用的鉴定是基于两个基因表达的同时丢失。当筛选等基因细胞系对时，单个感兴趣的基因要针对一个大的(全基因组)基因集合进行测试。一些技术平台，包括shRNA和CRISPR/Cas9，已经开发出来，可以在单个细胞中同时失活两个(甚至更多)基因。这种组合筛选可以在大量基因中生成多种不同人类细胞类型的遗传基因相互作用图。

生物信息学在合成致死性的预测

因为在癌症和一般疾病中寻找合成致死相互作用是一项令人生畏的实验任务，所以人们提出了许多方法来在生物信息学中实现这一预测。

半机械途径模型

半机械途径模型是预测的一种，其中包括研究细胞中特定途径或过程的方法，这些途径或过程总是由癌症类型和相关驱动基因决定的。这些方法的建立基于一些先验知识。虽然这些模型的范围有限，但它们的目标是捕捉少量路径内部和之间更复杂的线路模式。一旦这样的模型建立起来，就可以在生物信息学中研究合成致死相互作用。例如，Klinger等人(2013)应用了一种模块化响应分析的突变体来确定在结直肠癌中MAPK抑制时EGFR的反馈激活。类似地，也有预测模型被用于检测AGS胃癌细胞的合成致死相互作用(Flobak et al. 2015)。它模拟预测了五种协同作用，其中四种也得到了实验验证。包括已知的MEK AKT或MEK PI3K相互作用，以及涉及TAK1 AKT和TAK1 PI3K的新组合。

代谢网络模型

代谢网络模型包括专门使用代谢图的方法(Duarte等人，2007)，并通过组合生物信息学来研究合成致死作用和合成剂量致死作用。在合成致死的一对实验中，一方的过度活跃使另一方变得必不可少。在代谢网络方法中，通常将代表正常细胞的代谢网络中一个敲除与代表癌细胞的网络中进行相同的敲除进行对比。为了对后者进行建模，需要使用高通量分子数据，如基因表达数据，来识别特定癌症类型中异常影响的代谢反应。

一般的网络模型

第三类包括生物信息学在各种各样的大型基因-靶点-药物网络(或这些网络的组合)上的应用。这些方法包括

DrugComboRanker，它整合疾病网络和药物功能网络，然后利用疾病和药物网络的联合结构来识别由于疾病网络中的靶向模式而可能协同作用的药物。

TIMMA(目标抑制相互作用使用最大化和最小化平均法)利用亲和力测量得出的药物-靶点网络，并将其与大规模细胞系药物筛选相结合，以确定可能协同作用的靶点组合和相关药物组合。

Zhao等人(2011)开发了一种机器学习方法，通过使用一种药物靶点相互作用网络STITCH (Search Tool for interaction Chemicals)，并将其与感兴趣的药物集的性质(特征)相结合，如靶点和适应症，来预测协同药物组合。它们检测在已批准的药物组合中丰富的特征模式(特征组合)，可以预测新药组合，并提供关于联合治疗的机制见解。

大规模数据挖掘

最后一类是基于综合致死率的普遍原则对大规模数据集进行数据挖掘的方法，具体来说，是关于如何在癌症细胞的分子模式中挖掘出来。与其他类别的方法相比，这些方法不依赖于在路径图或网络中捕获的先验知识。

DIGRE(药物诱导基因组残留效应)计算模型：DIGRE(药物诱导基因组残留效应)计算模型是2014年DREAM表现最好的方法，旨在预测协同药物组合。该方法利用细胞系在一组药物存在下的基因表达谱，然后利用药物诱导基因表达谱的概念来预测协同作用。具体来说：

通过明确建模药物反应曲线和药物治疗后基因表达变化来预测药物联合效应。使用两个数据集来评估DIGRE的预测性能:

(i) OCI-LY3 b -淋巴瘤细胞与14种不同药物治疗。

(ii) MCF乳腺癌细胞与不同剂量的吉非替尼和多西他赛联合治疗。.

在两个数据集中，预测的药物联合效应与实验结果显著相关。结果表明，该模型可用于预测药物联合作用，这将极大地促进新的、有效的多药物治疗方法的发现。

LOBICO：癌症药物敏感性基因组学小组使用了对265种药物进行筛选的1001个癌细胞系来开发LOBICO(逻辑优化二进制输入到连续输出)，这是一种基于分子数据预测单一药物反应的方法。LOBICO是一个基于逻辑的模型，它选择少量的分子特征，并将这些特征组合成一个逻辑公式来预测药物反应。

将合成致死性应用到癌症治疗中

基因型选择性合成致死性

基因型选择性合成致命性利用了这样一个概念，即癌细胞获得突变几乎总是与可以靶向治疗的新弱点有关。这些缺陷可能是由于无法对特定信号作出反应，如DNA损伤或细胞周期阻滞，或无法维持细胞内稳态。这种方法的明显优势是，正常细胞缺乏这种突变，因此，不能对合成致死药物靶点显示出更高的敏感性。

举个例子：

乳腺癌

BRCA1和BRCA2基因的遗传性功能缺失突变易导致乳腺和卵巢肿瘤的发生。由于BRCA基因产物在双链DNA断裂修复过程中具有同源重组(homologous recombination, HR)的作用，因此推测抑制额外的DNA修复系统在BRCA基因功能丧失的情况下可能是致命的。并且已经证实，在碱基切除修复中起作用的多聚(adp -核糖)聚合酶(PARP)的抑制剂被发现在BRCA1和BRCA2基因突变中具有强合成致死力。

经过积极的临床研究， 2014年底，PARP抑制剂奥拉帕尼被批准用于治疗brca突变的卵巢癌。同源重组功能缺失的肿瘤对PARP抑制剂敏感的概念表明，失去了参与同源重组的其他酶的细胞也会对PARP抑制异常敏感。编码基因RAD51、RAD54、DSS1、RPA1、NBS1、ATR、ATM、CHK1、CHK2、FANCD2、FANCA或FANCC的缺陷也赋予了PARP抑制的敏感性。总的来说，由同源重组缺陷引起的表型被称为brcess，并且很可能所有表现出这种表型的细胞都会对PARP抑制产生反应。证实了合成致死性在临床治疗方面具有重要指导意义。

合成致死性的临床应用

唯一一种基于合成致死相互作用被批准用于临床的药物是PARP抑制剂，用于治疗brca突变癌症。然而，相当多的临床试验正在进行中，利用在实验室中确定的合成致命相互作用。基于上述BRAF和EGFR抑制剂之间的合成致死相互作用，一些试验正在进行中，包括编号为01719380,01750918和01791309的国家临床试验。在kras突变型癌症中，MEK抑制剂和panHER抑制剂之间的合成致死相互作用也有多个试验，包括编号为02039336、02230553和02450656的国家临床试验。许多研究人员已经预见到使用合成致命性基因筛查来识别药物组合和发现特定基因型癌症的特定弱点的巨大潜力。为了确定这种合成的致命相互作用，理解信号通路之间的串扰是很重要的，它经常混淆简单的基因型药物反应关系。正如上面所讨论的，仍需要花费大量的努力来绘制癌细胞中的信号反馈和串话电路，以确定信号通路之间的相互依赖关系，这将有助于加速合成致命药物组合的合理设计。

PARP抑制剂在癌症治疗中的临床评估。基于合成致死率概念的PARP抑制剂主要针对brca1 /2突变的生殖系肿瘤。各种PARP抑制剂已被监管机构批准，如美国食品和药物管理局(FDA)和欧洲药品管理局(EMA)，用于治疗brca突变的乳腺癌、胰腺癌和卵巢癌患者。奥拉帕尼目前正在进行2期临床试验，用于治疗晚期去势抵抗性前列腺癌。

小结：

合成致死对癌症研究有重要影响。合成致死率的概念为癌症治疗的发展开辟了一条新的途径，即在识别出癌症特异性突变后，靶向合成致死目标。随着越来越强大的工具和应用合成致死概念，药物靶点和遗传背景的确定无疑将是一种有效的治疗选择和患者的变革机会。不断发展的CRISPR筛选技术有可能解决肿瘤在初级耐药中的异质性和在次级耐药中的基因突变。多种抑制剂正在开发和测试的各个阶段，因此也需要仔细考虑机制，以最大限度地发挥这些药物的潜力。尽管这些方法具有巨大的潜力，但在从发现药物靶点到临床使用这些有效药物的过程中仍存在一些障碍。合成致命性为现在和未来的应用提供了更广泛的可能性。

在了解了合成致死性与研究人员以往对其的研究方法和进展之后，我们今天来介绍一篇去年8月最新见刊《Theranostics》（if=11.556）的一篇合成致死相互作用的文章，这篇文章介绍了与先前研究不同的研究方法和角度来分析肝癌合成致死相互作用的基因图景《Mapping the landscape of synthetic lethal interactions in liver cancer》

文献解读：

     绘制合成致死相互作用在肝癌中的图景

研究概览

目前几乎所有针对肝癌的治疗方法都是基于“一刀切”原则，只能提供有限的生存益处。幸运的是，合成致死(SL)可能为肝癌的个体化治疗提供了另一种途径。两个基因同时丢失对一个细胞来说是致命的，而一个基因丢失则是非致命的，这一概念可以被用来选择性地消除具有基因畸变的肿瘤。

本研究采用的SiLi是一个计算管道，用于使用高通量临床数据集从统计上推断候选SL交互，借鉴了一些以前的方法经验。该计算管道包括5个推理步骤:

(1)功能相似性分析，

(2)差异基因表达分析，

(3)两两基因共表达分析，

(4)两两生存分析，

(5)秩聚合分析。

SiLi的简要说明和验证

SiLi的简要说明

研究人员发现CDC7抑制剂可以选择性地抑制tp53突变型肝癌细胞株的生长和增殖，提示两者之间可能存在SL相互作用TP53和CDC7在肝癌中的作用(图A)。通过利用这一发现，我们可以简单地举例说明SiLi的实际应用，并检验用于SiLi发展的理论假设是否适用于这种真实的SL交互。功能相似度分析则给出了TP53-CDC7对的FS评分为0.654，高于研究人员设定的阈值(0.5)(图B)。CDC7在TP53突变体和TP53野生型样品中的表达差异分析表明，两组间存在显著差异，在TP53突变体样品中CDC7的表达高于TP53野生型样品(图C)。共表达分析显示TP53与CDC7显著正相关， Spearman相关系数值(0.187)也高于研究人员的阈值(0.15)(图D)。在两两生存分析中，研究人员观察到TP53和CDC7共同失活的患者的生存结果明显好于没有共同失活的患者(图E)。总的来说，这些分析结果不仅直观地展示了SiLi的流程，也在一定程度上证明了SiLi管道设计的合理性。

肝脏癌症中驱动基因的测定

确定候选驱动因素

为了确定候选驱动因素，研究人员对目前最全面的肝癌元数据集应用了一种基于网络的方法DriverNet，该方法包括了来自4个临床队列的849名肝癌患者，其中有表达和突变数据(图A)。该分析共得到34个q < 0.05的基因。其中,至少在之前的一项研究中，已有25个基因(73.5%)被报道为驱动候选基因，这证明了预测的可靠性(图B)。每个子类都有不同的突变特征。NBS1和NBS2的TSG突变比例较高(TSG的鉴定见下)，包括TP53、AXIN1、RB1、BAP1和BRD7，而NBS3的特点是CTNNB1突变频率高，TSG突变频率低(图C)。基于这一结果，将NBS1和NBS2定义为tsg富集子类。NBS的分类也与之前报道的基于转录组的分类有关。此外，生存分析显示，NBS三亚类患者的生存预后差异有统计学意义，NBS1的预后较NBS2 和NBS3 较差(图3D)。

肿瘤抑制基因-药物靶标-药物网络

肿瘤抑制基因-药物靶标-药物网络

SL相互作用的鉴定结果。(A) 272个TSG(肿瘤抑制基因)-DT(药物靶标)相互作用的二部网络。节点大小与节点度成正比。只有RAS分数最高的前30对TSG-DT配对被标记在图上。(B) 165个TSG - DT -药物相互作用的二部网络。对于内层的节点，节点大小与节点度值成正比。对于外层节点，节点大小与交叉分响应分析的折叠变化值成正比。图中只标注了变化倍数最高的前30对tsg - dt药物对。

驱动基因可以进一步分为两类:TSGs(肿瘤抑制基因)和致癌基因。TSGs的大部分改变导致基因功能的丧失，而癌基因的改变往往是功能获得突变。这两个驱动基因类之间的功能差异可能导致推断其SL伴侣的不同策略。

TSG-DT网络中目的基因的特征

基因的临床和生物学意义

272对TSG-DT中有209个独特的靶基因。为了评估这些基因的临床和生物学意义，研究人员使用来自元数据集的临床数据以及来自CRISPR和RNAi筛选的基因依赖数据进行了综合分析。与209个目标相关的生物过程首先进行了富集分析。大多数显著富集的过程，如E2F靶点、G2M checkpoint、MYC靶点V1等，都与细胞增殖相关，且与SL伙伴的功能基本一致(图A)。然后，研究这些基因在肿瘤组织和正常组织中的表达差异。通过调整阈值鉴定差异基因。 如预期的那样，所有的差异靶基因在肿瘤组织中的表达水平都高于正常组织(图B)。Cox比例风险回归分析也用于揭示其与生存结果的相关性。结果表明，209个显著基因(207个)均与不良预后相关(图C)。此外，还探讨了靶基因在肝癌细胞系中的依赖性。研究人员首先生成一个大小相同的随机基因集(209)，然后比较目标集和随机集的依赖分数。与使用crispr数据(图D)或rnai数据进行比较的随机组相比，目标组的依赖分数显著降低(图E)。TP53和PLK1共同参与细胞周期过程(图F)。为了描述肝癌中TP53和PLK1的关系，研究人员分析了PLK1在TP53-突变型和TP53-野生型肝癌细胞株上的依赖性得分(图G和H)。

tp53突变型肝癌新治疗方法的鉴定

tp53突变型肝癌新治疗方法的鉴定

目前有许多针对PLK1的小分子抑制剂。生物信息学分析结果表明，TP53突变可导致肿瘤对多种PLK1抑制剂治疗的敏感性提高(图A)。图B显示了这些PLK1抑制剂目前的临床状态和靶向特异性。其中，volasertib因其临床晚期、靶向特异性高而被选择进行进一步的实验验证。生信分析意向咨询

首先使用9个肝癌细胞株进行长期细胞增殖试验(图C)。定量结果显示，在不同浓度处理条件下，volasertib对tp53突变株的抗肿瘤活性均强于对tp53野生型细胞株(图D)。研究人员进一步进行了基于ctb的短期活力测定来验证这一结果。可以观察到，突变型tp53细胞株的细胞活力明显低于野生型tp53细胞株，这与长期检测结果一致(图E)。除了volasertib，另一种PLK1抑制剂GSK461364也被用于进行额外的验证。同样，GSK461364处理对tp53突变型细胞的抑制活性也优于tp53野生型细胞，这进一步证明了研究人员研究结果的可靠性。同时，为了探索PLK1抑制剂对凋亡通路的影响，研究人员进行了caspase 3/7检测，其中凋亡激活与绿色荧光强度成正比(图F)。突变的TP53细胞株比野生型TP53细胞株表现出更强的绿色荧光，提示PLK1抑制剂可能在TP53突变时具有更强的诱导凋亡的能力(图G)。总之，生物信息学预测和体外实验的一致结果证明了靶向PLK1治疗肝癌的潜力。

文献小结：

在本研究中，利用来自临床队列和功能基因筛查的公开数据，研究人员全面研究了PLK1在肝癌中的潜在治疗作用。显著的临床意义和高度的细胞依赖性都表明PLK1可能是一个有前途的肝癌治疗靶点。比较tp53突变体和tp53野生型样本对几种PLK1抑制剂的估计药物反应，发现与tp53野生型相比，在tp53突变体组PLK1抑制剂的AUC值更低(敏感性更高)。考虑到预测的药物反应不能代表实际情况，研究人员进一步进行了9个肝癌细胞株的体外实验，以验证在生物信息分析上的结果。正如预期的那样，实验结果与计算结果很好地吻合，共同证明了抑制PLK1有潜力成为一种新颖的、选择性的抗肝癌策略。

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引用文献：

1.Roderick L. Beijersbergen, Lodewyk F.A. Wessels, and Rene Bernards 《Synthetic Lethality in Cancer Therapeutics》 doi：10.1146/annurev-cancerbio-042016-073434

2.Win Topatana , Sarun Juengpanich , Shijie Li, Mingyu Chen and Xiujun Cai《Advances in synthetic lethality for cancer therapy: cellular mechanism and clinical translation》 doi：10.1186/s13045-020-00956-5