Attana Cell 200蛋白互作分析仪研究抗体药曲妥珠单抗

在抗体药物研发中，检测抗体与细胞的结合非常重要。使用石英晶体微天平（Quartz Crystal Microbalance，简称QCM），研究单克隆抗体曲妥珠单抗与表达人表皮生长因子受体2（HER2）的卵巢腺癌上皮细胞（SKOV3）的结合，是一项非常新颖的技术。

Elmlund等人的实验结果揭示出曲妥珠单抗与SKOV3细胞结合的平均解离常数KD值为7±1nM。实验过程中对细胞固定程序和接种密度等进行优化非常重要，为抗体药的亲和力研究提供了一种新方法。与纯化的抗原抗体的结合相比，抗体与靶细胞的结合更为自然。

这些结果证明了在药物开发中使用基于全细胞的QCM分析，用于筛选靶向HER2的候选药物的潜力。（Elmlund, L., et al. Study of the interaction of trastuzumab and skov3 epithelial cancer cells using a quartz crystal microbalance sensor. Sensors, 2015; 15(3): 5884–5894）

图1.赫赛汀抗体与SKOV3细胞表面HER2受体（蓝色）结合的示意图。将SKOV3细胞培养并固定在Attana Cell 200蛋白互作分析仪的COP-1检测芯片上，然后在其上注射赫赛汀，观察振动频率的变化，实时测定赫赛汀与细胞膜上的HER2结合能力。

图2.用不同浓度的甲醛（FA）和戊二醛（GA）对COP-1芯片上SKOV3细胞进行固定后，采取DAPI染色。荧光显微镜观察发现，随甲醛（FA）浓度的升高，固定在芯片上的细胞也越多；而随戊二醛（GA）浓度的升高，固定在芯片上的细胞的数量不变或者稍有减少。后续实验选择3.7% FA和0.5% GA对芯片上的细胞进行固定。

图3.采用3.7%甲醛（FA）固定芯片上SKOV3细胞，注射20μg/mL赫赛汀后，Attana蛋白互作分析仪绘制出了一条结合点和解离点均很明显的结合曲线。

图4.采用0.5% GA戊二醛（GA）的固定方法时，虽然频率改变很大（达到17Hz左右），但是在解离阶段，曲线迅速下降、很快回复到基线类似水平，这一结果代表此时的结合很弱或发生了非特异性结合。因此，0.5% GA戊二醛（GA）固定对本次实验不合适。

图5.对比不同浓度的FA固定，2%浓度固定时，最大反应频率随抗体浓度增加并没有增加，因此有可能是芯片的非特异性结合。而5%浓度固定时，最大反应频率虽然与抗体浓度基本成比例增加，但是波动较大。在结合5%浓度固定时，染色较亮，这时很可能也发生了非特异性结合。因此后续实验选择3.7%FA固定。

图6.优化细胞接种密度（接种2万、4万、8万细胞），再DAPI染色，荧光显微镜观察发现在8×104的细胞接种密度下，不仅能制出一条结合点和解离点均很明显的结合曲线、20μg/mL的赫赛汀不会使其饱和，并且解离常数的平均值为KD=7±1nM，此结果与其他基于全细胞水平的分析得出的结果（KD=5nM）相一致。

在药物开发的早期研究和对生物分子间识别的基础性研究中，通常采用的是以纯化受体或细胞裂解物为基础的体外分析方法。这类方法不仅费时、成本高、抗体需要标记而且灵敏度也较低。生物大分子在标记后会影响分子之间的相互作用特性，并且增加非特异结合。而传统的生物传感器需要将纯化后的靶标分子固定在传感器表面，这些脱离了生理条件的靶标分子可能会发生构象上的改变，使得实验结果不能真实反映生理条件下分子间的相互作用。

Attana Cell 200蛋白互作分析仪采用石英晶体微量天平（QCM）技术，能快速、无需标记、直接在细胞表面准确地定性和定量测量分子间的相互作用，填补了传统的生物大分子互作分析系统与细胞分析方法之间的空白。

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