组学技术—— CUT&Tag

蛋白质与DNA之间的相互作用具有十分重要的生物学意义，例如：转录因子与基因组DNA的相互作用对于基因的表达具有调控作用；基因组不同位置的不同类型的组蛋白往往会与基因的表达活性相关联等。

而在蛋白质与DNA之间的相互作用研究当中，ChIP-seq当属经典技术，可以说为后来一系列技术的发展开拓了很好的思路，但是传统的ChIP-seq也存在一些问题：

• 信号比较杂，背景噪声很大，所以常常需要input的数据来进行背景的处理；
• 细胞数量要求较高，在实现利用少量细胞进行实验的方面有一定的困难；
• 实验耗时长，一般需要3天才能完成整套实验流程；
• 数据的重复性较差，且需要利用超声打断基因组DNA，打断的条件需要经过摸索，需有一定的经验基础。

CUT&Tag技术优势

在2019年，美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的 Henikoff 博士在 Nature Communications上首次发布 CUT&Tag 技术^[1]，相比较于ChIP-seq技术，CUT&Tag 在这些方面具有独特优势：

• 对于起始实验细胞数量没有较高要求，据说可以最低60个细胞（还是要看你做的转录因子是什么吧）；
• 一般来说不需要进行甲醛交联（注意是一般）；
• 不需要进行超声打断（所以一般不需要甲醛交联）；
• 不需要进行免疫共沉淀的实验过程。

当然，整项技术还是基于抗原抗体结合反应进行构建的，上面的优势决定了 CUT&Tag 具有以下特点：

CUT&Tag

• 相较之于ChIP-seq具有更低的背景噪声（以至于一般进行数据分析可以不用input的数据来去除背景）；（track2 vs track4）
• 高精度（细胞数）；（track1 vs track2 vs track4)

Reproducibility and efficiency of CUT&Tag

• 具有更高的数据可重复性；

Efficiency of CUT&Tag

• 具有更高的捕获效率。

关于甲醛交联

在ChIP-seq中常常使用到的甲醛交联主要是让蛋白质一蛋白质,蛋白质一DNA,蛋白质一RNA之间交联，最主要的目的还是让我们想研究的蛋白质与DNA之间的相互作用更加紧密，防止在后续的实验中导致脱落。但是这也会带来一些问题：

• 甲醛交联的活性仅限于胺，而且交联效率也很低，所以需要的细胞数量就很大；
• 可能导致蛋白与蛋白、蛋白与核酸之间的非特异性结合，使实验结果出现假阳性；
• 蛋白与蛋白之间的交联还有可能遮盖抗原表位，使得抗体作用性能降低。

2014年发表在 Brief Funct Genomics 上的文章 In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis 就专门就甲醛交联在研究蛋白与DNA之间的相互作用提出了可能存在的问题，甲醛交联并不能交联所有蛋白与DNA之间的相互作用，例如 lac阻遏蛋白和 NF-kB 就不会被交联^[2]。总之就是大家不要把甲醛交联想的那么神，那么万能。

注意我前面提到的 CUT&Tag 一般不需要甲醛交联，为什么是一般？如果你所要研究的转录因子与基因组的结合较弱或者量很少，这个时候为了得到的更好的实验结果，你就可能需要使用甲醛进行轻交联，同样是美国弗雷德哈钦森癌症研究中心的 Henikoff 博士课题组，他们在2020年将 CUT&Tag 实验流程发表在 Nature Protocols 上，其中就提到了使用甲醛进行轻交联的可选步骤（0.1%的甲醛室温下交联2分钟）^[3]，ChIP-seq 的甲醛交联可是使用1%的甲醛交联10-15分钟！

CUT&Tag流程概述

CUT&tag

• 细胞收集

不同于传统的每次离心收集细胞，CUT&Tag 使用连有刀豆蛋白A的磁珠（concanavalin A beads）进行细胞的收集，刀豆蛋白能够与细胞进行结合（原理是与膜上的糖蛋白结合）。然后利用磁珠每次收集细胞。结合后还需要使用非离子去垢剂洋地黄皂苷（digitonin）对细胞膜进行通透（原理是与胆固醇分子结合），为抗体等的进入提供可能性。

• 一抗、二抗结合

这里的一抗就是针对你的研究靶蛋白所设计的特异性抗体，必要时需要辅助IP实验检验抗体的特异性。

• Tn5转座酶结合

这里一般使用Protein A/G-Tn5体系来实现Tn5转座酶的结合，proteinA/G对于IgG的Fc段具有很高的亲和性，常常被应用于IgG抗体的纯化，所以使用proteinA/G就能把Tn5转座酶带到IgG二抗结合的基因组位点。

• 片段化

通过添加含有镁离子的反应液使Tn5转座酶开始发挥作用，这里面的细节可以参考我前面的帖子组学技术——ATAC-seq。

• DNA提取与文库构建

关于对照组的设置

如果你确实有设置对照组的需求，CUT&Tag一般会有两种对照：阳性对照一般选择与基因组DNA相互作用较高的蛋白，例如组蛋白；阴性对照可以使用不加入一抗而正常加入二抗和Tn5转座酶的体系，查看是否存在Tn5转座酶乱切的情况，或者也可加入非特异性的IgG作为阴性对照。

References
[1] Kaya-Okur, Hatice S et al. CUT&Tag for efficient epigenomic profiling of small samples and single cells. Nature communications vol. 10,1 1930. 29 Apr. 2019, doi:10.1038/s41467-019-09982-5.
[2] Gavrilov, Alexey et al. In vivo formaldehyde cross-linking: it is time for black box analysis. Briefings in functional genomics vol. 14,2 (2015): 163-5. doi:10.1093/bfgp/elu037.
[3] Kaya-Okur, Hatice S et al. Efficient low-cost chromatin profiling with CUT&Tag. Nature protocols vol. 15,10 (2020): 3264-3283. doi:10.1038/s41596-020-0373-x.