Transient hepatic reconstitution

T cell support signals decline with age

Para1:
为筛选能恢复免疫功能的信号分子，本研究对多个年龄点的小鼠进行了分析（包括adult: 4-week、15-week、middle aged: 32-week、48-week、aged: 79-week、90-week）。具体方法为：对其外周血T细胞进行scRNA或TCR测序，并对T细胞生成的主要器官——胸腺进行空间转录组测序。质控后，共获得约9.7万个T细胞的单细胞转录组数据，以及覆盖约126万个胸腺位置的47个空间阵列数据(Extended Data Fig. 1a–h)。分析发现，随着年龄的增加，T细胞亚群的组成比例发生了改变：naïve和stem-like T细胞比例下降，而memory 和exhaustion-like T细胞比例增多(Extended Data Figs. 1e,h and 2)，该结果与既往报道一致。

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• Extended Fig1 A: 小鼠样本的选择，跨越整个生命周期
• Extended Fig1 B：通过流式从外周血中完成单细胞→活细胞→淋巴细胞(标志物：CD45)→T细胞（CD3+）的筛选，然后去做测序。Tip：CD3+ T cells：是所有T细胞的总称，包括CD4/CD8、Naive/Memory、Treg
• Extended Fig1 C-D：筛选出CD8+ T的单细胞，分成1-7个亚群；并用经典标志物做进一步确定，表明C图细胞注释结果正确
• Extended Fig1 E：将4-week小鼠作为参照组，将其他各年龄组中7个T细胞亚群的比例与之比较，计算公式为log2(Proportion1/Proportion2) ，结果大于0表示该亚群在实验组中比例升高，反之降低。图中数据显示，CD8_IFN-responsive亚群的比例在各实验组中随年龄增长呈递减趋势。
• Extended Fig1F-H 结果与上述Extended Fig1C-E相同，鉴定出了随着年龄的增长，CD4各亚群的变化情况。

Note: “.. with loss of naive (Tcf7, Sell and Ccr7) and stem-like populations (Bcl11b, Lef1, Id3 and Sox4) ..”但在图中并没有找到stem-like populations

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• Extended Data Fig. 2 跟Extended Data Fig. 1 所描述的其实是一件事，只不过指标不同。A也是做细胞注释的时候用的marker gene，结果同Extended Fig1 C-D和Extended Fig1 F-G，B-C图表明不同年龄段的样本主要集中在哪些细胞亚群中，可以看出随着年龄的增加，无论对CD8+还是CD4+右上侧细胞类群的比例在逐步减少，左侧细胞类群的比例在上升。

Para2:
基于空间转录组数据，分析了胸腺细胞与胸腺上皮细胞（下文简称TEC）之间随年龄变化的信号互作强度。结果显示，皮质区TEC与胸腺细胞间的信号传导随衰老显著减弱，而髓质区二者的相互作用则相对稳定。（Extended Data Fig. 3a,b）。

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• Extended Data Fig. 3A-B：分别表示皮质层和髓系层TEC和T细胞interaction随年龄的变化情况。分别用correlation 和vlnplot来表示。

Para3:
基于空间转录组和单细胞转录组数据（使用工具：Squidpy、CellPhoneDB及Omnipath），发现① Notch1/3与IL-7信号通路在老年组中显著下调（Fig. 1b,c及Extended Data Fig. 3c,d）；② 老年小鼠的胸腺内T细胞及外周循环T细胞中，均检测到Notch、IL-7和FLT3L下游靶基因的表达下降，相关信号活性也随之减弱（Fig. 1b,c及Extended Data Fig. 3e,f）。此外，除T细胞，③胸腺内成纤维细胞产生的可溶性FLT3L同样随年龄增长而降低（Fig. 1d及Extended Data Fig. 3g）。因此，最终选择三种免疫营养因子——DLL1（用于激活Notch）、FLT3L和IL-7——诱导其表达，以期恢复老年宿主体内免疫信号。

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• Fig1b-c分别展示了Notch1/3及IL-7信号的分析结果：基于空转数据，左图是胸腺皮质上皮细胞与胸腺细胞间的空间配体-受体互作强度；右图是通路活性评分。二者均随年龄的衰老而减弱。
• Extended Data Fig. 3C-D：受体-配体互作热图，左侧是随年龄减少的通路，右侧相反。
• Extended Data Fig. 3E：基于单细胞数据，Notch, FLT3, and IL-7三条通路的打分
• Extended Data Fig. 3F：上述三者靶向的下游基因在aged中被下调
• Extended Data Fig. 3G：各年龄组小鼠离体胸腺组织中FLT3-L蛋白的绝对表达水平。

Tip：为什么要比较皮质区和髓质区？
皮质区是T细胞发育的早期阶段；髓质区是T细胞发育的晚期阶段。那这个结果就表明了衰老过程中，主要是T早期发育的过程受损，这引导后续更应该关注祖细胞做了铺垫。

Tip:为什么计算TEC与T的强度，而不是其他细胞与T的强度?
衰老导致的免疫功能衰退，其源头很可能就是cTEC功能的丧失，进而导致新生T细胞产出不足。

Tip：为什么检测成纤维细胞的FLT3-L蛋白？
因为胸腺基质细胞也通过分泌可溶性信号分子支持T细胞的成熟。

Note：如何从三条pathway中筛选出靶蛋白文中没有做过多的说明。