一个RNA-seq实战-超级简单-2小时搞定
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准备工作：
安装WSL，并将源换成国内源；
在D盘建立文件夹bs用来放生信软件，文件夹data用来放下载的数据，data下建立文件夹fastq用来放测序数据，gtf用来放注释文件，hg19用来放index文件，map用来放比对排序等文件。
1、数据下载
数据在GEO地址是：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE50177，可知RNA-Seq数据为：
Run Sample
SRR957680 siSUZ12_BiolRep2
SRR957679 siSUZ12_BiolRep1
SRR957678 siCtrl_BiolRep2
SRR957677 siCtrl_BiolRep1
for i in {77..80}; do wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov ... /SRR/SRR957/SRR9576${i}/SRR9576{i}.sra; done
2、数据处理
（1）安装软件
wget https://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.g ... 2-1-ubuntu64.tar.gz
tar -zxvf sratoolkit.2.8.2-1-ubuntu64.tar.gz
echo ‘PATH =$PATH:/mnt/d/bs/sratoolkit.2.8.1-1/bin’ >> ~/.bashrc
source ~/.bashrc
（2）将sra文件转化为fastq格式
for i in {77..80};do fastq-dump --gzip --split-3 -O /mnt/d/data/fastq -A /mnt/d/data/SRR9576${i}.sra;done
（3）下载安装FastQC软件
sudo apt install fastqc
（4）对fastq文件进行质控
ls *.gz | while read id; do fastqc $id -o /mnt/d/data/fastqc -t 4; done
3、序列比对
（1）下载index文件：
wget -c ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz
tar zxvf hg19.tar.gz
（2）下载安装hisat2软件
sudo apt install hisat2
（3）正式比对
for i in {77..80};do hisat2 -t -x /mnt/d/data/hg19/genome -U /mnt/d/data/fastq/SRR9576{i}.sam;done
（4）下载安装SAMtools软件
sudo apt install samtools
（5）SAMtools转换为bam排序
for i in {77..80}; do samtools view -S SRR9576{i}.bam; samtools sort SRR9576
{i}_sorted.bam; samtools index SRR9576${i}_sorted.bam; done
4、reads计数
（1）下载安装HTSeq-count软件
sudo apt-get install python-numpy python-matplotlib python-pysam python-htseq
（2）下载注释文件
wget ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/genco ... 7.annotation.gtf.gz
gzip -d gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz
（3）htseq-count计数
for i in {77..80}; do htseq-count -s no -f bam /mnt/d/data/map/SRR9576{i}.count; done
（4）合成表达矩阵（在R中操作）
（i）分别读取count文件
options(stringsAsFactors = FALSE)
m_control_1<-read.table("d:/data/map/SRR957677.count",sep="\t",col.names=c("gene_id","m_control1"))
m_control_2<-read.table("d:/data/map/SRR957678.count",sep="\t",col.names=c("gene_id","m_control2"))
m_case_1<-read.table("d:/data/map/SRR957679.count",sep="\t",col.names=c("gene_id","m_suz1"))
m_case_2<-read.table("d:/data/map/SRR957680.count",sep="\t",col.names=c("gene_id","m_suz2"))
（ii）按照gene_id合并
m_raw_count<-merge(merge(m_control_1,m_control_2,by="gene_id"),merge(m_case_1,m_case_2,by="gene_id"))
write.csv(m_raw_count,file="d:/data/map/m_raw_count.txt",quote=FALSE,row.names=FALSE) #见附件
（iii）简单分析
summary(m_raw_count)
5、差异表达分析（在R中进行操作）
（1）安装DESeq2
install.packages("BiocManager")
BiocManager::install("DESeq2")
BiocManager::install("GenomeInfoDbData")
library(DESeq2)
（2）差异表达分析
database<-read.table(file="d:/data/map/m_raw_count.txt",sep=",",header=T,row.names=1)
database<-round(as.matrix(database))
condition<-factor(c(rep("control",2),rep("suz",2)),levels=c("control","suz"))
coldata<-data.frame(row.names=colnames(database),condition)
dds<-DESeqDataSetFromMatrix(countData=database,colData=coldata,design=~condition)
dds <- dds[rowSums(counts(dds))>1,]
dds <- DESeq(dds)
res <- results(dds)
（3）提取差异分析结果
res <- res[order(res$padj),]
diff_gene <- subset(res,padj<0.05 & (log2FoldChange>1 | log2FoldChange < -1))
diff_gene <- row.names(diff_gene)
resdata <- merge(as.data.frame(res),as.data.frame(counts(dds,normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)
write.csv(resdata,file="d:/data/map/control_vs_suz.csv",row.names=F) #得到csv格式的差异表达分析结果
到此运行正常，但后续用clusterProfiler做富集分析时出错，出错提示见附图。请教一下是哪一步有错误？
