血液样本如何开展eccDNA研究？
以下分享5篇使用血液样本开展eccDNA研究的文章。
文献1 ：Circular dna elements of chromosomal origin are commom in healthyhuman somatic tissue
本文研究了健康人的组织和血液中eccDNA分布情况。以16个人的肌肉和血液为样本，检测到约100000个特异性的eccDNA。
这些eccDNA分布在各个基因组结构上，包括基因区，基因间隔区和重复区域。其中一半的eccDNA携带基因或者基因片段，并且大部分eccDNA小于25kb。基因丰富的染色体更容易产生eccDNA。
本文的研究结果表明，体细胞内有大量的染色体来源eccDNA，这些eccDNA可以通过改变基因的拷贝数或者基因的转录长度来影响表型。
样本设计
- 8名运动型男性，取肌肉和血液
- 8名非运动型男性，取肌肉和血液
样本处理
- 肌肉：局部麻醉，取股外侧肌，立即液氮速冻，-80℃保存
- 血液：静脉抽取40ml血液，分离白细胞，并进一步分离细胞核，-80℃保存
文章亮点
介绍了eccDNA的验证方法和eccDNA转录本的鉴定。
通过Circle-seq得到的eccDNA，可以利用outward PCR 扩增juntion区域（下图蓝色箭头），凝胶电泳和Sanger测序进行验证，同时设立一个inward PCR（下图黑色箭头）作为阳性对照。
图1 eccDNA验证
通过转录组测序，寻找有跨juntion区域的转录本，这些转录本就是eccDNA转录的 RNA。
图2 eccDNA转录本鉴定
原文链接:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5852086/
文献2 ：The presence of tumor extrachomosomal circular DNA (ecDNA) as acomponent of liquid biopsy in blood
作者假设血液ecDNA可以作为肿瘤患者的液体活检标记物，并对这一假设进行评估。
首先介绍了相关背景，ecDNA存在于大部分癌症中，可以增加癌基因的拷贝数，而正常细胞中几乎没有。因此作者假设在efDNA诊断中增加ecDNA，可以为肿瘤的液体活检带来重大突破。
然后作者通过eccDNA的研究方法对这一假设进行评估，认为Circle-seq 技术适用于eccDNA研究。最后作者阐述了eccDNA在肿瘤液体活检上的应用前景。
综上，作者提出，癌症患者血液存在ecDNA，利用Circle-seq技术对其进行鉴定，可以使肿瘤的诊断和预后更容易。
图3 eccDNA作为液体活检的标记物
原文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0306987717304796?via%3Dihub
文献3 ：Identification and characterization of extrachromosomal circular DNAin maternal plasma
作者首先研究母体血浆中是否有胎儿释放的eccDNA，发现孕妇的血浆中同时有母亲和胎儿的eccDNA。
这些eccDNA的长度分布呈现双峰，分别是202bp左右和338bp左右，两个峰之间有明显的10bp的周期性，揭示他们的核小体起源。同时，338bp的优势峰说明血浆中的eccDNA比线性DNA长。
eccDNA在基因组上的注释发现，eccDNA来源于5′-UTR、外显子区域和CpG岛。
然后作者对比了母亲和胎儿的eccDNA，发现胎儿来源的eccDNA比母亲来源的eccDNA短。最后作者分析了eccDNA的形成机制，Junction位点两侧的重复序列说明eccDNA有多种生成机制。
样本设置和处理
- 8例孕妇外周血样本，外周血离心分离出血浆，提取cfDNA
文章亮点
建立了一种区分母亲eccDNA和胎儿eccDNA的方法。
图4 胎儿eccDNA 和母亲eccDNA鉴定
原文链接：https://www.pnas.org/content/117/3/1658.full
文献4 ：Molecular characterization of cell-free eccDNAs in human plasma
作者在人的血浆样本中，检测到大量细胞外的eccDNA。eccDNA检测效果跟DNA的投入量、富集效率有关和测序深度有关。EccDNA的长度在31bp-19989bp之间。小的eccDNA（＜500bp）GC含量明显高于大的eccDNA（>500bp）。同时作者还发现eccDNA在外显子区域和3′UTR 区域有明显的分布，这些区域也富集了DNase 敏感位点、H3K4me1和H3K27ac。Junction序列分析说明，非同源末端连接机制在eccDNA形成过程中的作用。对外周血中eccDNA的描述将促进eccDNA分子机制和潜在临床应用研究。
样本设置和处理
- 3例外周血样本，分离血浆，-80℃保存，从血浆中得到cfDNA，进一步富集eccDNA。
为了研究富集效果，每个人的cfDNA分成不同的浓度进行实验，同时设置水作为阴性对照。
文章亮点
文章开发了一种从cfDNA中鉴定eccDNA的流程。
图 5 从cfDNA中鉴定eccDNA流程
原文链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/28887493/
文献4 ：DNA sequences homologous to hepatitis C virus (HCV) in the extrachromosomal
circular DNA in peripheral blood mononuclear cells of HCV-negative subjects（HCV 阴性者外周血单核细胞的染色体外环状 DNA 中与 HCV 同源的 DNA 序列）
文章研究与丙型肝炎病毒（HCV）基因组RNA序列同源的染色外环状DNA（eccDNA）序列。
作者从HCV阴性的PBMC中富集eccDNA，利用PCR扩增技术，发现HCV 5′非编码区序列存在于eccDNA组分上。同时，甲基化分析结果显示了个体间的甲基化模式所代表的受遗传调控的表观遗传特征。
样本设置和处理
- 5例HCV阴性外周血样本，外周血分离PBMC，并进一步富集eccDNA。
