单细胞笔记3-scATAC-seq介绍
ATAC-seq
ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with highthroughput sequencing）是利用转座酶研究染色质可及性的高通量测序技术。
染色质可及性
首先介绍一下什么是染色质可及性。正常情况下，DNA与核小体缠绕折叠在一起形成染色质，但是DNA的复制、转录都需要将染色体的高级结构解开，然而解开并不需要打开全部染色体，只需要打开表达基因的区域，这部分打开的染色质，就叫开放染色质（open chromatin）。而染色质一旦打开，就允许一些调控蛋白（比如转录因子和辅因子）跑过来与之相结合。而染色质的这种特性，就叫做染色质的可及性（chromatin accessibility）。
ATAC-seq原理
DNA转座，是一种把DNA序列从染色体的一个区域搬运到另外一个区域的现象，由DNA转座酶来实现。这种转座插入DNA，需要插入位点的染色质是开放的，因此，如下图A，我们只要人为地将携带已知DNA序列标签的转座复合物（即带着红色蓝色测序标签的转座酶Tn5）加入到细胞核中，这样他就会插入到开放的染色质区域，再利用已知序列的标签进行PCR后测序，就知道哪些区域是开放染色质了，这也就是ATAC-seq的原理。最后得到的DNA片段，包括了开放区域的剪切片段，也包括了横跨一个或多个核小体的长片段。
ATAC-seq示意图
根据片段长度，可以将片段分为分为Fragments in nucleosome-free regions(<147 base pairs)（不包含核小体的片段）、Fragments flanking a single nucleosome (147~294 base pairs)（包含一个核小体的片段）, 以及更长的多核片段。片段长度分布如下图，不包含核小体的片段最多，其次是单核片段，依次递减。
ATAC-seq片段分布图
ATAC-seq出来的结果，和传统方法出来的结果具有很强的一致性，同时也和基于组蛋白修饰marker的ChIP-seq有较高的吻合程度。也就是说，ATAC-seq中的peak，往往是启动子、增强子序列，以及一些反式调控因子结合的位点。
scATAC-seq建库原理
ATAC-seq是把所有实验细胞看作了一个整体，获得所有细胞混合的基因信息。scATAC-seq是在ATAC-seq的基础上，进行细胞核的分选和标记通过barcode识别细胞核，解决了不同细胞群体的异质性的问题，能够检测出混杂样品测序所无法得到的异质性信息。
以10x 建库方法为例，比较scATAC-seq 和scRNA-seq建库方法的异同
二者都用胶珠（GEMs）的方法，不一样的是ATAC胶珠上的序列中不用UMI，因为基因组只有一对序列，无需像RNA一样定量。另外序列末端用接头引物Read 1N代替PolyT。
scRNA-seq通过结合cDNA的PolyA尾进行扩增，而scATAC-seq的DNA片段没有PolyA尾，取而代之的是Tn5酶转座剪切时插入的adaptors片段，可以与胶珠上的Read 1N序列互补。
DNA片段接上胶珠后，在另一端加Read2和Sample index序列。在此之前，scRNA-seq需要将cDNA酶切至合适的片段长度，而scATAC-seq的片段不进行打碎，接上Sample index和P7序列后进行扩增。
最后上机测序。scRNAseq如果是3‘单端测序，Read2读取最近的100bp读长，而Read1只读取16bp的细胞barcode序列和10bp的UMI序列，共26bp。scATAC-seq则用双末端测序，读长一般不低于45bp。
scATAC-seq最后可以得到4个原始文件：
其中I1/2分别是barcode和sample index，R1/2是目的片段的双末端。
下游分析（以Signac为例）
Signac包由Seurat同一团队开发，独立于Seurat包，在2020年8月开始发布在GitHub上。目前仍是1.0.0版本。
1. 加载peaks, 细胞注释和片段分布数据，并创建object。这个object和Seurat object类似，只是在assay里多了peaks等信息。这里的features不是基因，而是基因组的注释区域，如启动子，增强子等。
2. 质控
3. 降维聚类
4. 创建基因活性矩阵。之前的聚类区域所用的features是peaks，为了展示不同分群基因活性的差异，首先要将scATAC-seq数据产生的peak matrix转换整合成一个gene activity matrix（基因活性矩阵）。我们基于这样一个简单的假设：基因的表达活性可以简单的通过基因上下游2kb范围内覆盖的reads数的加和进行定量，最后获得一个gene * cell的表达矩阵
5. 与scRNA-seq数据的整合分析
6. 寻找细胞分群特异的peaks
7. 展示基因在不同细胞类型的开放程度
8. 此外还有其他分析，如TF footprinting等。footprinting顾名思义是指转录因子留下的印记，由于Tn5酶不能剪切到TF结合的区域，所以footprinting图相对与TSS图，中间有“凹陷”，凹陷的程度根据TF结合的时间确定
