7+免疫激活与免疫抑制联合分析方法
肿瘤微环境中免疫激活和免疫抑制机制之间的平衡能够预测肿瘤免疫检查点抑制疗法的疗效。因此，今天小编就和大家分享一篇今年2月发表在BRITISH JOURNAL OF CANCER（IF：7.640）杂志上关于计算免疫激活与免疫抑制平衡得分的文章，做免疫的小伙伴不要错过呀。
A balance score between immune stimulatory and suppressive microenvironments identifies mediators of tumour immunity and predicts pan-cancer survival
泛癌中识别肿瘤免疫介质及预测生存的免疫激活与抑制微环境的平衡得分
一． 研究背景
有研究发现肿瘤中高密度活化T细胞的活跃免疫微环境与良好的预后及免疫治疗的应答有关。然而，目前癌症免疫所进行的转录组学研究主要用的是基因特征或模块，这种分析仅能捕获一个或一组相互紧密连接或相关的过程。相较而言，同时分析激活和抑制这两种免疫信号可能会更好地定义肿瘤免疫微环境的真实免疫状态，这也有助于捕捉与免疫相关的相反信号之间的平衡。因此，今天介绍的文章就计算了一个免疫激活与免疫抑制的平衡得分（MIRACLE），并在泛癌中对得分的预后效能等进行了分析。
二． 数据及方法
1. 数据收集：研究从TCGA下载31种癌症的表达数据及临床数据。除了TCGA外作者还从GEO、 European Nucleotide Archive 及Short Read Archive下载相关数据，其中GEO数据集等被视为单独的研究，即使被标注为相同的实体肿瘤队列，也不会被合并。
2. 数据处理：1）RNA序列：研究使用Trim_Galore/CutAdapt处理原始fastq文件，接着使用STAR比对，然后使用GenomicAlignments Bioconductor的summarizeOverlaps函数得到原始的基因counts，最后对基因counts数据进行标准化。2）芯片数据：研究从GEO下载Affymetrix.CEL文件，并使用GEOquery包的justRMA 函数标准化。
3. 基因集富集分析：作者使用yaGST包进行单样本基因集富集。其中预先计算的TCGA癌症免疫景观评分从相应的文献下载。而评估免疫和基质特征从各自的出版物下载，这些特征中缺失数据或异常的被过滤。最终，在28个TCGA实体队列的生存和相关分析中，共使用76个特征作为实体微环境中抗癌症免疫反应的介质（MIRACLE）的基准。
4. 基于免疫排斥常数(ICR)的生存相关性队列分层：研究使用连续的ICR基因特征的标准化富集评分(NESs)识别28个TCGA队列的生存相关性。生存相关性为阳性的队列被指定为ICR-Enabled(IE)队列，而生存相关性为显著阴性的队列被指定为ICR-Disabled (ID)队列。
5. 差异表达：为了确定IE和ID队列中与ICR相关的基因组特征，作者根据第一和第三分位数的NES定义高富集和低富集水平，在ICR高富集和ICR低富集的样本之间进行了有监督的差异表达分析。采用非参数Wilcoxon检验，对基因进行筛选，这些基因构成了IE和ID基因集。
6. 计算MIRACLE得分：研究中定义MIRACLE是给定样本中IE和ID两个top基因集的单样本富集分数的比值。作者使用yaGST包中MWI-GST的NES，即NES是对基因在基因组中表达大于基因在基因组外表达的概率的估计：NES=1-U/m*n。其中m是基因集中的基因数目，n是基因集外的基因数，U=m*n+m(m+1)-T,其中T是基因集中基因的秩次数。
7. GO及网络分析：研究中作者使用Cytoscape Suite中的BiNGO进行GO富集分析。作者使用Cytoscape EnrichmentMap在网络图中可视化GO富集并对BiNGO输出进行了过滤。在网络图(richmentMap)中，节点的大小与基因集的大小成正比，而边的粗细与GO条目的相关性成正比。
8. 生存分析：分析中作者采用单因素及多因素分析检验每个队列中特征的预后价值。
9. ICI应答的定义及数据集：研究中将根据RECIST标准分类为进展性疾病的患者被视为无应答者，分类为完全缓解、部分缓解或稳定疾病的患者都被视为应答者。ROC曲线和AUC值使用pROC包根据计算。
三、研究的主要内容及结果
1. 免疫平衡得分在预测泛癌症生存方面优于先进的免疫特征
在文章的第一部分作者使基于ICR使用图1a的方法开发了一个平衡得分。研究首先从TCGA数据库中识别出具有高度活跃免疫表型且有利的生存相关及表型与生存不利相关的癌症类型。 作者将这两组癌症类型分别分为ICR-enabled（IE）和ICR-disabled(ID)组。而与其他ICR没有显示相关性的癌症类型被归类为中性ICR组(ICR-neutral)。接着在IE肿瘤中对ICR高表达的样本与ICR低表达的样本之间进行监督分析，结果识别1493个差异表达基因。接下来作者对ID肿瘤进行同样的分析，获得了1265个差异表达基因。其中两个组有888个共出现基因，有605个与ICR特征正相关的基因只在IE队列中，377个与ICR特征正相关的基因只在ID队列中(图1a)。研究中作者关注最后两个列表，并根据基因在两个监督分析中的差异表达进行排序，及根据基因在两个列表中的差异排秩对每个基因进行评分。对于IE特异性列表中的每个基因，计算ΔRIE = RIE-RID，其中RIE和RID分别是该基因在IE和ID差异表达列表中的排秩。通过ΔRIE重新排秩的top基因被保留进一步分析。同样，ID特异列表中的基因按照相反的方法进行评分ΔRID = RID-RIE。MIRACLE得分是IE和ID特异基因集合中按ΔRIE和ΔRID排秩的top基因的NESs之比(图1b)。接下来作者发现在TCGA队列中，MIRACLE得分具有很高的预后效能(图1c)。接着作者将MIRACLE得分与最近在泛癌研究中报道的76种不同的免疫评分相比，发现在TCGA中MIRACLE是最显著的生存预测因子。同时作者也进行多因素分析，研究MIRACLE预后价值的独立性。
图1免疫激活和抑制微环境之间平衡得分的开发
2. MIRACLE评分将炎症与基质评分/TGFβ信号通路和其他免疫抑制信号解耦
由于MIRACLE是由ICR信号诱导的DEGs衍生而来，因此，在文章的第二部分作者通过评估它们与一组免疫相关指标的相关性来分析这两个评分之间的差异（图2）。结果发现ICR(图2a)与T细胞浸润的其他特征等高度相关。此外，ICR与免疫抑制信号也具有适度但一致的相关性。而MIRACLE(图2b)评分与这些抑制特征不相关或反相关，与Th1极化T细胞浸润的所有特征高度相关。接下来为了更好地阐明定义的MIRACLE评分特征的功能作用，作者对IE肿瘤特异性基因和ID特异性基因进行了GO富集分析（图3），结果发现在这些GO条目的自组织网络图中，IE和ID特征反映了两个对立的网络。
图2免疫通路与MIRACLE评分相关
图3MIRACLE特征的功能富集
3. 与MIRACLE评分相关的基因组学事件
在文章的第三部分作者分析了特异性致癌突变与MIRACLE评分的关系。如图4所示作者选择了一组高频突变的470个癌症基因，然后训练了一个弹性网络模型来预测MIRACLE得分，作为每个样本的突变函数，并使用队列作为协变量。训练模型的正系数用于识别哪些基因的突变与MIRACLE评分的增加有关，而负系数用于识别哪些基因的突变与MIRACLE评分的降低有关(图4)。接下来作者通过十倍交叉验证来评估模型的准确性，同时计算模型预测和真实MIRACLE评分之间的相关性。结果发现与MIRACLE呈正相关的顶级突变基因包括与癌症亚型的差异存活率相关的基因，如IDH1等。
图4基因组事件与MIRACLE呈正相关或负相关
4. MIRACLE评分在免疫检查点治疗中的预测价值
在上述分析中，作者已经刻画了MIRACLE对预后的影响及相关的生物学意义。接下来，在文章的最后一部分，作者为了确定MIRACLE评分在免疫检查点治疗中的临床相关性，评估了MIRACLE评分在抗CTLA4和抗程序性细胞死亡蛋白1 (anti-PD1)治疗的多个公开数据集上的预测价值。作者分析了91个抗PD1或抗PD1 及抗CTLA-4联合治疗的黑色素瘤患者。结果发现当治疗前和治疗中分别分析时，应答者的MIRACLE评分显著更高。所有患者的预测AUC为0.78，而抗PD1治疗子集的预测AUC达到0.81(图5a)。接着作者研究了109例抗PD1治疗前或治疗中黑色素瘤患者的样本。同样，在所有样本中，在治疗前和治疗后亚组中，应答者的MIRACLE得分显著更高。当样本是基于以前的检查点治疗(anti-CTLA4)的子集时，MIRACLE与检查点治疗进展样本的反应选择性相关(图5b)。接下来作者利用微阵列数据对65例接受重组MAGEA3抗原免疫治疗的患者的治疗前黑色素瘤样本进行了分析。结果发现MIRACLE得分在应答者中显著更高。同时在另一组42例接受抗CTLA4治疗的黑色素瘤患者的基因表达数据中发现MIRACLE评分与应答、总生存率显著相关(图5c)。综上所述，可以发现与其他免疫相关特征相比，MIRACLE、ICR和TIS具有最多数据集的预测能力。
图5MIRACLE预测ICI的应答
到这里这篇文章的主要内容就介绍完了，文章针对泛癌构建了一个微环境中免疫激活和免疫抑制平衡的得分特征。并对得分进行了评估以及从功能预后价值等方面进行了刻画。可以看出文章篇幅不是很长所用到的方法也不是很复杂，但是使用数据多，选择的研究角度也很好，在泛癌中刻画了免疫激活及免疫抑制平衡的特征，同时也探索了功能及预后价值，免疫激活及免疫抑制联合分析的这种研究角度值得我们学习。
