易基因｜疾病研究：DNA甲基化与转录组分析联合揭示吸烟免疫相关疾

2021年12月09日，《Clin Epigenetics》杂志发表了题为“Genome-wide methylation and expression analyses reveal the epigenetic landscape of immune-related diseases for tobacco smoking”的研究论文，该研究通过转录组测序（RNA-seq）和全基因组DNA甲基化测序（WGBS）分析联合揭示吸烟诱导的免疫相关疾病的表观遗传机制。

标题：Genome-wide methylation and expression analyses reveal the epigenetic landscape of immune-related diseases for tobacco smoking（全基因组DNA甲基化和表达分析揭示了吸烟免疫相关疾病的表观遗传机制）

时间：2021.12.09

期刊：Clinical Epigenetics

影响因子：IF 7.259

技术平台：WGBS、RNA-seq

样本实验：分别采集36名吸烟男性和36名非吸烟男性的全血样本进行WGBS测序分析，对38名吸烟男性和37名非吸烟男性的全血样本进行RNA-seq分析。

图1：实验策略

为克服目前DNA甲基化芯片检测技术在全基因组中仅能捕获有限数量CpG位点的局限性，本研究对72名男性进行了全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）。根据全基因组测序（WGS）数据集，去除罕见变异（MAF<0.05）。还对75名当地男性个体进行RNA-seq分析，旨在从基因组水平上揭示吸烟者和非吸烟者之间的差异表达基因。

摘要：

背景

吸烟是肺癌、慢性阻塞性肺病（COPD）、心血管疾病（CVD）的主要致病危险因素，也是世界上可预防的主要死亡原因。香烟烟雾的成分参与免疫和炎症过程，可能会增加吸烟相关疾病的患病率。然而，吸烟与疾病之间的潜在分子机制尚未得到很好的探索。本研究旨在通过全基因组重亚硫酸盐测序（WGBS）和转录组测序（RNA-seq）绘制吸烟诱导的全基因组DNA甲基化和基因表达变化图谱，探索吸烟与人类疾病之间的分子机制。

（1）分析烟草对吸烟成年男性的全基因组DNA甲基化水平变化影响；

（2）研究吸烟引起的DNA甲基化与对应的RNA基因表达之间的关系；

（3）综合分析DNA甲基化、RNA基因表达和细胞因子浓度结果，多层面揭示吸烟引起的免疫相关疾病的分子机制，探索吸烟与相关疾病之间的关系。

结果

作者对72个全血样本（36名吸烟者和36名非吸烟者）进行WGBS测序分析，对75个样本（38名吸烟者和37名非吸烟者）进行RNA-seq测序分析，并对22名男性（9名吸烟者和13名非吸吸烟者）的血浆样本进行细胞因子免疫检测。对两组WGBS数据差异分析，结果发现与吸烟相关的差异甲基化区域（DMR）的全基因组甲基化图谱。功能富集分析表明吸烟相关的高DMR基因（DMG）和低DMG都与突触相关通路有关，而低DMG与癌症和成瘾有特异性相关。RNA-seq分析揭示的差异表达基因（DEG）在“免疫抑制”通路中显著富集。DMR与其对应基因表达的相关性分析表明，受吸烟影响的基因主要与免疫系统疾病有关。最后，通过比较吸烟者和非吸烟者之间的细胞因子浓度，发现吸烟者的血管内皮生长因子（VEGF）显著上调。

结论

本研究发现吸烟诱导的DMR在吸烟者和非吸烟者之间的高甲基化和低甲基化区域具有不同的分布模式。通过DNA甲基化组和转录组数据的多组学综合分析进一步鉴定并验证了吸烟相关的DMG和DEG。这些发现提供了吸烟诱导的全基因组分子变化图谱，增强了人们对吸烟危害及其与疾病关系的理解。

结果图形

（1）吸烟与全基因组DNA甲基化变化的相关性

表1：样本特征

图2：WGBS绘制的CpG基因组分布图。

A. 基于CpG密度的CpG分布图。

B. 基于基因组位置的CpG分布图。

C.  全基因组各位点的DNA甲基化水平分布。

注：X=甲基化水平；Y=甲基化水平对应的CpG位点密度；WGBS =全基因组重亚硫酸盐测序

图3：全基因组中SM-DMR分布。

A.   吸烟与全基因组DNA甲基化水平变化相关。圆圈代表高甲基化（红色外圈）和低甲基化（蓝色内圈）的DNA甲基化水平。线条高度表示吸烟者和非吸烟者之间的甲基化变化。

B.  基于基因组位置的DMR分布比例和富集结果。红色和蓝色条表示吸烟相关（SM）的DMR，灰色条表示1000组调控区域的平均比例。

C. 基于Roadmap Epigenomics Project的不同细胞类型和组织中表观基因组注释的SM-DMR富集结果。

D.  前15条通路的高甲基化和低甲基化DMG的KEGG通路富集分析。

（2）差异表达基因（DEG）鉴定

图4：在DNA甲基化和RNA基因表达中检测到的基因。

A.  吸烟者和非吸烟者之间差异表达基因火山图。每个点对应一个基因，颜色对应于方向。

B.  通过DisGeNET对DEGs进行通路富集分析。

C.   DMG和DEG之间的重叠基因。

D.   通过DisGeNET对甲基化和mRNA数据集中的重叠基因进行通路富集分析。点图显示了前20条最显著富集通路。

（3）DMR甲基化与基因表达的相关性分析

表2：通过Metascape对DNA甲基化和RNA-seq数据集的常见基因进行通路富集分析，此表显示前20条通路 表3：甲基化和表达关联分析 图5：各靶基因的甲基化与表达水平相关性分析。每个点对应一个样本，颜色对应每个组。直线代表拟合曲线，R和P值分别代表Spearman相关系数和P值

（4）吸烟相关的低甲基化与FLT1表达上调的关系

图6：吸烟者和非吸烟者在VEGF和VEGFR1上的差异分析

A.  吸烟者和非吸烟者之间VEGF细胞因子水平比较分析

B.  吸烟者和非吸烟者之间FLT1/VEGFR1的DNA甲基化水平比较分析

C.  吸烟者和非吸烟者之间FLT1/VEGFR1 的RNA表达水平比较分析。

D.   吸烟者和非吸烟者之间VEGF及其受体的DNA甲基化水平分析。

每个点对应一个样本，颜色对应于每个组。VEGF：血管内皮生长因子，VEGFR1：血管内皮生长因子受体1

结论：

本研究通过WGBS和对应的RNA-seq对人的全血DNA甲基化水平和转录组基因表达进行全基因组测序分析，证明了与吸烟潜在相关的分子变化。通过比较吸烟者和非吸烟者的DNA甲基化水平，发现吸烟诱导的DMR在高甲基化和低甲基化区域具有不同的分布模式。此外，通过DNA甲基化组和转录组数据的多组学功能和相关性分析进一步鉴定和验证了与吸烟相关的DMG和DEG，该领域的全基因组图谱的完成对吸烟危害及其与疾病关系的理解提供了一个完善的基础。

参考文献：

MaoY, Huang P, Wang Y, Wang M, Li MD, Yang Z. Genome-wide methylation andexpression analyses reveal the epigenetic landscape of immune-related diseasesfor tobacco smoking. Clin Epigenetics. 2021 Dec 9;13(1):215.