Cre-LoxP条件性基因编辑系统--学习笔记
背景
Cre/LoxP系统来源于F1噬菌体，是非常经典有效的基因编辑技术。
1. 什么是Cre
Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA 重组。
Cre就是一个重组酶，可以识别LoxP位点。
https://www.addgene.org/cre-lox/ addgene上的介绍
（1）如果loxP位点位于相同的DNA链上，并且方向相反，那么重组就会导致反转，并且loxP位点之间的DNA区域是反向的。
（2）如果这些位点面向同一方向，则loxP位点之间的序列作为一段环状DNA被切除(并且不被保留)。
（3）如果这些位点位于不同的DNA链上，loxP位点就会产生一个易位事件。
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首先我们需要将Cre载入到细胞中，此时已经有成熟的试剂盒可以做到。
通过CRISPR-Cas9系统，可以将CreER插入到AAVS1（腺样病毒相关位点1），藉由AAVS1安全港的作用，稳定表达CreER。可是CreER可能会泄露，既在没有他莫昔芬的情况下，也可能会敲LoxP（简称犯浑），这时候应该加入双重保障。
Cre调控方式
Inducible Cre: These constructs require the addition of an exogenous ligand (e.g. tamoxifen) to activate Cre. One advantage of this system is tight temporal regulation.
（1）诱导Cre：这些结构需要添加外源性配体(如他莫昔芬)来激活Cre。这个系统的一个优点是严格的时间管理--这一个是我们最常用到的！
Promoter-regulated Cre: The promoter region defines the areas in which Cre will be expressed. Cre may be expressed globally under a broadly active promoter like CAG, or expressed only in a subset of cells under a more specific promoter (e.g. Rho-Cre is expressed in the retina).
（2）启动子调控的Cre：启动子区域定义了Cre表达的区域。Cre可能在广泛活跃的启动子(如CAG)下全局表达，也可能仅在特定启动子下的细胞子集中表达(如Rho-Cre在视网膜中表达)。
Fluorescent Cre: The fusion of Cre to a fluorescent reporter enables visualization of Cre expression.
（3）Cre与荧光报告基因的融合使Cre表达可以可视化--可以直接看见荧光哦！
Optimized Cre: Codon-optimized Cre (iCre) is expressed at higher levels in mice than P1 bacteriophage Cre, facilitating high rates of Cre-driven recombination. CREM (or Cre-M) has been engineered to contain an intron, preventing Cre expression when cloning in E. coli. This alteration enables the generation of a single vector containing Cre and a floxed construct (unmodified Cre will cause recombination in E. coli, deleting the floxed portion of a construct during the cloning process). VCre and SCre are alternative Cre recombinases that recognize specific mutant loxP sites, VloxP and SloxP sites respectively.
（4）嗯......好复杂
Split Cre: Cre recombinase is split in half into N and C terminal Cre fragments (NCre and CCre, respectively) and placed under the control of different promoters. Expression of both N and CCre in the same cell type allows for recombination of LoxP flanked DNA sequences.
（5）将Cre重组酶分为N和C端Cre片段(分别为NCre和CCre)，置于不同启动子的控制下。N和CCre在同一细胞类型中的表达允许LoxP侧边DNA序列的重组。
2. 什么是LoxP
loxP是一段长34bp的DNA序列，是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。
参考资料：
https://info.abmgood.com/blog/introduction-to-cre-lox
https://www.addgene.org/cre-lox/
这些LoxP结构允许crec调控基因表达，Cre可激活或抑制基因表达，这取决于其结构。常见构造类型包括：
（1）依赖于Cre的基因表达：在感兴趣的基因上游，在任何一侧（通常称为“lox-stop-lox”或“LSL”盒）放置一个带有loxP位点的停止密码子，可以防止Cre缺失时的基因表达。在Cre存在的情况下，停止密码子被切除，基因表达继续进行。
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（2）依赖于Cre的基因敲除：相反，将loxP位点放在基因的两侧(称为“floxing”，即“side by loxP”)将允许基因表达，直到Cre出现，此时基因将被破坏或删除。
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（3）Cre-dependent shRNA Expression: Cre-lox被当做调节shRNA结构的开关. **在floxd-shRNA结构中，Cre可切除shRNA，使基因表达恢复到生理水平。在lox-STOP-lox shRNA构建中，Cre表达促进shRNA表达。其实跟上面是一样的，只不过（1-2）说的是基因的表达，这里是shRNA。
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（4）Gene Switch: 在这里有两个目的基因：A and B. 当Cre缺失时，只有A的转录是正常的，Cre表达时则切除基因A，改变阅读框，允许基因B在框内翻译。
https://www.researchgate.net/figure/Gene-switch-strategy-using-cre-LOX-induced-translational-frameshift-A-Gene-1-flanked_fig3_11928708
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（5） FLEx Switch: 抑制A基因表达的同时激活B基因。For more information on FLEx switch and what you can do with it read Addgene's Blog on FLEx Vectors。对它感兴趣的话，请进一步阅读学习。
3. 什么是AAVS1
为啥要突然提到AAVS1？是因为以上提到的LoxP我们已经知道，应该把LoxP放在目的基因的内含子中（中间是外显子，最好是功能区外显子）。而Cre想要稳定表达怎么办呢？这时候就要借助AAVS1位点的作用了。已有试剂盒可以做到
AAVS1 位点（又称为 PPP1R2C 位点）位于人类基因组第19号染色体，是一个经过验证、能确保转入 DNA 片段预期功能的“安全港”位点。该位点是一个开放的染色体结构，能保证转入基因能被正常转录。另外很重要的一点是在该位点插入外源目的片段对细胞无已知的副作用。
