Westen Blotting常遇到的一些问题及解决方法
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
实验流程
提取与处理样品蛋白 —— 电泳分离样品蛋白 —— 转移蛋白至杂交膜 —— 封闭非特异性位点 —— 一抗孵育 —— 洗涤 —— 二抗孵育 —— 洗涤 —— 底物显色或曝光检测
常见问题及解决方法
Q&A
无信号（白板）/弱信号（不是白板胜似白板）
1. 样品
✦ 样品中无目的蛋白或目的蛋白降解——
（1）设立阳性对照（2）检查封闭液是否有蛋白（3）使用蛋白酶抑制剂
✦ 上样量不够或蛋白表达丰度较低———
（1）增加上样量（2）浓缩纯化样品
2. 转膜
✦ 转膜不完全——（1）转膜后使用丽春红染色（2）使用蛋白质Marker
✦ 洗涤过度——减少洗涤时间和次数
3. 封闭
✦ 封闭过度——（1）减少封闭液浓度及封闭时间（2）更换封闭时间
4. 抗体孵育和检测头
✦ 抗体浓度和检测时间不够——（1）增加抗体浓度（2）延长孵育时间
✦ 一抗不工作——设置阳性对照
✦ 二抗不工作——和其他一抗配合检测二抗是否工作
✦ 一抗/二抗不匹配——检查抗体的来源和亚型，正确选择二抗
✦ 底物失活或灵敏度低——（1）重新配置有效底物（2）更换高灵敏度底物
Q&A
高背景（黑板或几近黑板）
1. 封闭
✦ 封闭时间不够——延长封闭时间
✦ 封闭液和抗体有交叉反应——
（1）更换封闭液，优化封闭试剂的类型和浓度 （2）加Tween-20减少交叉反应
✦ 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭液——推荐BSA封闭
2. 抗体孵育和检测
✦ 一抗/二抗浓度太高——降低抗体浓度（主要是二抗）
✦ 孵育温度太高——建议4度孵育过夜
3. 其他
✦ 洗膜不充分——5*3 mins，多次短时间洗膜
✦ 曝光时间过长——缩短曝光时间
✦ 出现干膜现象——保证膜充分浸透，避免出现干膜
✦ 二抗非特异性——设置只加二抗对照
Q&A
非特异性条带（杂带）
1. 样品制备
✦ 二聚体或多聚体——还原变性电泳
✦ 蛋白不同剪切体——实验论证
✦ 蛋白降解——（1）使用新鲜样品（2）加蛋白酶抑制剂
✦ 上样量过大——减少上样量
2. 封闭
✦ 封闭不充分——优化封闭时间和浓度
3. 抗体孵育和检测
✦ 一抗/二抗浓度太高——降低抗体浓度（主要是一抗）
✦ 抗体没有经过纯化——纯化或更换抗体
✦ 二抗非特异性结合——使用二抗对照
4. 其他
✦ 洗膜保证充分
Q&A
脏带（操作），补丁染色
✦ 脏带（操作问题）——（1）戴手套（2）用平头镊子（3）避免折叠、刮擦、膜的粘贴
✦ 补丁染色——（1）一抗浓度不够：增加一抗浓度（2）抗体孵育不均匀：摇床（3）干膜：保持湿润（4）细菌污染：加防腐剂或更换抗体；配制新鲜缓冲液
Q&A
表情条带（微笑，皱眉等）
✦ 微笑条带：主要由于凝胶中部聚合不完全，多见于较厚凝胶，也可由于上样量过大——室温静置充分凝固；调节上样量
✦ 皱眉条带：凝胶和玻璃挡板底部有气泡或凝胶两边聚合不完全或上样量过大——在两板间加入适量缓冲液；完全凝胶；重新配胶；调整上样量
Q&A
闹鬼（鬼带，鬼影）
✦ “鬼带”：大分子构象复杂蛋白质分子未完全变性或轻微复性；高含量高纯度蛋白存在 ——（1）加热煮沸后，再添加适量的DTT或Bate巯基乙醇，补充不足的还原剂（2）加适量EDTA阻止还原剂的氧化（3）分离或过滤样品
✦ “鬼影”（条带中心透亮）：上样量过大，目的蛋白过多——适当减少上样
Q&A
碰到的其他问题
✦ 溴酚蓝不能起到指示作用（溴酚蓝已跑出板底，蛋白质却还未跑下来）：主要与缓冲液和分离胶浓度有关——更换正确pH的Buffer；降低分离胶浓度
✦ 较粗条带：样品浓缩不佳或上样量过大——适当增加浓缩胶长度；保证浓缩胶pH 6.7；适当降低电压；减少上样量
✦ 电泳电压很高而电流却很低：电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。包括：内外槽装反外槽液过少；电泳槽底部的绝缘体未去掉；上样孔中过多气泡——正确装配电泳槽；增加电泳液；以电泳缓冲液赶走气泡
✦ 浓缩胶与分离胶断裂：拔梳子用力不均匀或过猛；封闭下胶的水或正丁醇未弃净——温柔拔梳；弃净上胶部液体；重新配胶
✦ 板间气泡：解除制胶夹后板未夹紧而致空气进入；解除制胶夹用力过大——温柔并正确操作；气泡大时重新配胶
✦ 样品被蛋白酶降解/样品磷酸化：添加蛋白酶抑制剂Cocktail/磷酸酶抑制剂Cocktail，所有操作保持4℃以下冰上操作，并防止冻融
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