RNAseq实际操作（实战）

首先声明，虽然是实战，但是其实是学习笔记而已，初学，参考了大量大神的博客和帖子,还有大神引用的大牛的帖子,参考列表见最后。

1、软件安装

1.1 硬件系统情况

系统：BioLinux8（ubuntu14.04.2-x64）

吐槽个一下这个系统，普通帐户竟然环境变量错误（source ~/.bashrc)，对我等小白来说实在头大，只有用root用户运行了。

后来通过百度错误问题发现，这个系统用的是zsh，所以更新环境变量的代码是 source ~/.zshrc 这样就可以了。

电脑配置：

Lenovo-ThinkPad-E431

CPU系列 英特尔 酷睿i3 3代系列
CPU型号 Intel 酷睿i3 3120M
CPU主频 2.5GHz
总线规格 DMI 5 GT/s
三级缓存 3MB
核心架构 Ivy Bridge
核心/线程数 双核心/四线程
制程工艺 22nm
内存容量 12GB（4GB×1 + 8GB×1）

1.2 软件安装

有简单的不必去重新编译代码了，bioconda几个命令解决，可能软件依赖会有点问题。

1）Miniconda安装

wget https://repo.continuum.io/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh

source ~/.zshrc

一路Enter搞定

2）sratoolkit

conda install -c jfear sratoolkit

3）fastqc

conda install fastqc

发现fastqc是BioLinux自带的，执行这个命令只是升级了java

4）hisat2

conda install hisat2

hisat2 -h #测试

这有个小插曲，提示hisat2依赖于python3.5, 而我装的是3.6，于是百度得知用conda安装3.5版本的：

conda install python=3.5

5）samtools

conda install samtools
samtools

''#samtools也是自带的，执行这个命令会说依赖冲突，因为我的conda是Python3.6版，有点新，不兼容正常。

6）htseq-count

conda install -c bioconda htseq

’#测试

python

>>> import HTSeq

7）R

BioLinux自带了，升级一下到3.4.1

sudo add-apt-repository ppa:marutter/rrutter

sudo apt-get update

sudo apt-get install r-base r-base-dev

8）rstudio

conda install rstudio

rstudio

2、读文章拿到测序数据

直接拿jimmy的脚本修改得来的。仔细分析项目数据后，得到要下载的数据是SRR3589958-62

这个脚本包含了下载数据，sra格式转化为fastq，fastqc对转化的数据进行分析，代码如下：

for ((i=958;i<=958;i++)) ;do wget ftp://ftp-trace.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByStudy/sra/SRP/SRP075/SRP075747/SRR3589$i/SRR3589$i.sra;done

ls *sra |while read id; do fastq-dump --gzip --split-3 $id;done

看到大神用的.gz格式才发现太省空间了，至少省了一半以上，膜拜！

3、了解fastq测序数据（fastqc质量控制学习）

1.fastqc

zcat SRR3589956_1.fastq.gz | fastqc -t 4 stdin
fastqc SRR3589956_1.fastq.gz
#t 线程，每个250M内存

2.multiQC

conda install multiqc
# 先获取QC结果

ls *gz | while read id; do fastqc -t 4 $id; done

# multiqc

multiqc *fastqc.zip --pdf

学习笔记是纸质版拍照的，哈哈。

4、了解参考基因组及基因注释

1）下载参考基因组
wget http://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg19/bigZips/chromFa.tar.gz #wget 下载或者其他工具下载

tar -zvf chromFa.tar.gz

cat *.fa > hg19.fa

rm chr*

2）下载基因组注释gtf文件

GTF和GFF之间的区别：

数据结构：都是由9列构成，分别是reference sequence name; annotation source; feature type; start coordinate; end coordinate; score; strand; frame; attributes.前8列都是相同的，第9列不同。

GFF第9列：都是以键值对的形式，键值之间用“=”连接，不同属性之间用“；”分隔，都是以ID这个属性开始。下图中有两个ID，说明是不同的序列。

GTF第9列：同样以键值对的形式，键值之间是以空格区分，值用双引号括起来；不同属性之间用“；”分隔；开头必须是<u>gene_id, transcipt_id</u>两个属性。

wget ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/gencode/Gencode_human/release_26/GRCh37_mapping/gencode.v26lift37.annotation.gtf.gz]ftp://ftp.sanger.ac.uk/pub/genco ... 7.annotation.gtf.gz

3)下载IGV(Integrative Genomics Viewer)

下载地址为： http://software.broadinstitute.org/software/igv/download

4)genome -> Load Genome From Files加载之前得到基因组文件

5)Tool -> Run igvtools，进行排序

6)加载gff基因注释文件，File -> Load From Files

7)可视化分析
同样推荐阅读生信宝典公众号文章。

https://mp.weixin.qq.com/s/Q7pqycmQH58xU6hw_LECWA

5、序列比对

5.1 下载index

cd referece && mkdir index && cd index
wget ftp://ftp.ccb.jhu.edu/pub/infphilo/hisat2/data/hg19.tar.gz
tar -zxvf hg19.tar.gz

5.2 比对

mkdir -p RNA-Seq/aligned
for i in seq ‘56 58’
do

hisat2 -t -x reference/index/hg19/genome -1 RNA-Seq/SRR35899${i}_1.fastq.gz -2 SRR35899${i}_2.fastq.gz -S RNA-Seq/aligned/SRR35899${i}.sam 

done

5.3 HISAT2输出结果

两个同时跑，资源几乎占满。报错，改为硬件不足，后来才发现是硬盘爆了，于是上移动硬盘

两个同时跑，资源几乎占满。报错，以为硬件不足，后来才发现是硬盘爆了，于是上移动硬盘。

5.4 格式转换，排序，索引

for i in `seq 56 58`
do
    samtools view -S SRR35899${i}.sam -b > SRR35899${i}.bam
    samtools sort SRR35899${i}.bam SRR35899${i}_sorted.bam 
    #这里我用的是0.1.19版本，不用加参数 -o    
    #ps:我加了-o之后重定向输出结果有5个G之工巨，xshell直接死机，直接运行，电脑终端一直不停跳乱码的东西。
    samtools index SRR35899${i}_sorted.bam
done

判断sam排序两种方式的不同：

head -100 SRR3589957.sam > test.sam
samtools view -b  test.sam > test.bam
samtools view test.bam | head

默认排序

samtools sort test.bam default
samtools view default.bam | head

Sort alignments by leftmost coordinates, or by read name when -n is used

samtools sort -n test.bam sort_left
samtools view sort_left.bam | head

5.5 samtools view

提取1号染色体1234-123456区域的比对read

samtools view SRR3589957_sorted.bam chr1:1234-123456 | head

flagstat看下总体情况

samtools flagstat SRR3589957_sorted.bam

用samtools筛选恰好配对的read,就需要用0x10

samtools view -b -f 0x10 SRR3589957_sorted.bam chr1:1234-123456  > flag.bam
samtools flagstat flag.bam

5.6 比对质控(QC)

# Python2.7环境下
pip install RSeQC

对bam文件进行统计分析(70~90的比对率要求)

bam_stat.py -i SRR3589956_sorted.bam

基因组覆盖率的QC

需要提供bed文件，可以直接RSeQC的网站下载(看文件只有1M多，就没有考虑转换):

wget https://downloads.sourceforge.net/project/rseqc/BED/Human_Ho<br>mo_sapiens/hg19_RefSeq.bed.gz

read_distribution.py -i RNA-Seq/aligned/SRR3589956_sorted.bam -r reference/hg19_RefSeq.bed

5.7 IGV查看

载入参考序列，注释和BAM文件

6 reads计数

# 安装
conda install htseq
# 使用
# htseq-count [options] <alignment_file> <gtf_file>
htseq-count -r pos -f bam RNA-Seq/aligned/SRR3589957_sorted.bam reference/gencode.v26lift37.annotation.sorted.gtf > SRR3589957.count

循环处理多个BAM文件：

mkdir -p RNA-Seq/matrix/
for i in `seq 56 58`
do
    htseq-count -s no -r pos -f bam RNA-Seq/aligned/SRR35899${i}_sorted.bam reference/gencode.v26lift37.annotation.sorted.gtf > RNA-Seq/matrix/SRR35899${i}.count 2> RNA-Seq/matrix/SRR35899${i}.log
done

合并表达矩阵

在生信媛的python脚本上略做了修改

!/usr/bin/python3
def combine_count(count_list):
  mydict = {}
  for file in count_list:
      for line in open(file, 'r'):
          #print(line)
          if line.startswith('E'):
              key,value = line.strip().split('\t')
              if key in mydict:
                  mydict[key] = mydict[key] + '\t' + value
              else:
                  mydict[key] = value

  sorted_mydict = sorted(mydict)
  out = open('count_out.txt', 'w')

  for k in sorted_mydict:
      #print(k, mydict[k])
      #break
      out.write(k + '\t' + mydict[k] +'\n')
    
    
count_list = ['SRR3589956.count', 'SRR3589957.count', 'SRR3589958.count']

combine_count(count_list)

简单分析(这里由于对R接触还很少，不少命令不明白，只有运行一下试试)

1. 导入数据

options(stringsAsFactors = FALSE)# import data if sample are small
control <- read.table("/media/biolinux/LENOVO_imcdul/biodata/SRR3589956.count",sep="\t", col.names = c("gene_id","control"))

2. 数据整合

# merge data and delete the unuseful row
raw_count <- merge(merge(control, rep1, by="gene_id"), rep2, by="gene_id")
raw_count_filt <- raw_count[-1:-5,]
ENSEMBL <- gsub("(.*?)\\.\\d*?_\\d", "\\1", raw_count_filt$gene_id)
row.names(raw_count_filt) <- ENSEMBL

3） 总体情况

summary(raw_count_filt)

4）看几个具体基因

> GAPDH <- raw_count_filt[rownames(raw_count_filt)=="ENSG00000111640",]
#EBI上搜索GAPDH找到ID为ENSG00000111640
> GAPDH

文章研究的AKAP95（ENSG00000105127）的表达量在KD中都降低了

> AKAP95 <- raw_count_filt[rownames(raw_count_filt)=="ENSG00000105127",]
> AKAP95

参考内容列表：

1、http://www.biotrainee.com/forum.php?mod=viewthread&tid=1750#lastpost#jimmy的导航贴

2、转录组（一）](http://www.biotrainee.com/thread-1800-1-1.html) ( HOPTOP )

3、转录组入门(1)](http://www.biotrainee.com/thread-1796-1-1.html)- (青山屋主)

4、转录组入门（1）Mac上软件准备作业

5、PANDA姐的转录组入门(1)：计算机资源的准备

6、转录组作业（一）：来自零基础的小白

7、转录组入门(2)：读文章拿到测序数据

[转录组入门（二） New(HOPTOP)

8、转录组入门(2)-（青山屋主)

9、PANDA姐的转录组入门(2)：读文章拿到测序数据

10、转录组入门(3)：了解fastq测序数据

11、转录组（三）：（HOPTOP）

12、转录组入门(3)-（青山屋主）

13、PANDA姐的转录组入门(3):了解fastq测序数据

转录组入门(4)：了解参考基因组及基因注释

14、hoptop的：转录组作业（四）

转录组入门(5)： 序列比对

15、转录组入门(5)](http://www.biotrainee.com/thread-1870-1-1.html)： 序列比对（HOPTOP）

转录组入门(6)： reads计数

16、生信媛

转录组入门(7)： 差异基因分析

17、生信媛

18、http://www.bio-info-trainee.com/2218.html
https://jiawen.zd200572.com