科普讲堂|谈谈Illumina mRNA测序文库构建过程

转录组测序很多人都做过，但你真的了解转录组测序吗？知其然，更要知其所以然，才能对数据结果理解更深入，今天，小编给大家详细介绍下Illumina转录组测序文库的构建过程，里面肯定有你不知道的知识，赶紧get下吧！

mRNA建库主要分为Poly(A)抓取（mRNA富集）、双链cDNA合成、末端修复/加“A”、接头连接、片段分选、PCR扩增和PCR产物质检七个部分。

图1 mRNA建库基本流程

一、Poly(A)抓取

Total RNA除了含有mRNA以外，还含有nc RNA、rRNA和tRNA,因此需要对mRNA进行分离纯化。因为真核生物的mRNA与原核生物的mRNA结构有明显的区分，真核生物的mRNA的3’端具有Poly(A)尾结构，而其他的RNA没有，所以可以用Oligo(dT)磁珠与mRNA的Poly(A)尾特异性结合从而去除其他的RNA，继续回收磁珠，将带有Poly(A)的mRNA从磁珠上洗脱下来，然后用带有镁离子的试剂将mRNA打断。

注意：在建库的时候会对mRNA的完整度有较高的要求，我们所用的Oligo(dT)磁珠只会吸附靠近3’端的Poly(A)尾，如果mRNA发生了降解，那5’端的mRNA就不会被吸附上。

图2 磁珠抓取流程图

二、双链cDNA合成

cDNA一链合成：以被片段化的mRNA为模板，dNTPs为底物，在逆转录酶的作用下反转录合成cDNA，RNase H是指核糖核酸酶H，是一种核糖核酸内切酶，可以特异性地水解DNA-RNA杂合链中的RNA。

合成二链：以被片段化的cDNA为模板， dNTPs为底物，在DNA聚合酶的作用下合成双链cDNA。

三、末端修复/加“A”

末端补平：T4 DNA polymerase &DNA polymerase I (Klenow-)

1）促进DNA向 5’→3’ 方向聚合；

2）是3’→5’ 外切核酸酶，有3’→5’ 外切酶活性；

3）无5' →3' 外切核酸酶。

T4 PNK：T4磷酸激酶，应用于DNA或RNA5’末端的磷酸化，以便进行连接反应，失去3’→5’ 外切酶活性。

图3 末端修复及加“A”流程图

四、接头连接

经过末端修饰的PCR片段的末端具有突出的A尾，而接头具有突出的T尾，可以使用T4 DNA连接酶将接头(Adaptor)添加到DNA片段的两边，添加的接头主要是为了后续PCR中作为引物扩增时可以继续添加index。

NEB的接头为特殊的碱基U连接的环状结构，因此连接接头后还需要用USER Enzyme去除碱基U将环状结构切断，形成Y型接头。

图4 接头连接流程图

五、片段分选

添加接头后的体系中含有聚合酶、连接酶等各种酶，接头的添加也是过量的，而且也可能会有大片段的存在，所以需要用磁珠进行双筛来去除大片段以及各种杂质，从而获得成功添加接头的文库片段，双筛时要根据不同的文库片段来控制磁珠添加量，若添加了PEG等增强剂，则需要先进行纯化，再继续双筛。

图5 短接头文库分选推荐磁珠比例

六、PCR扩增

加了接头的DNA片段，可以使用与接头互补的引物来进行扩增，片段上还需要添加用于区分不同的文库的index(一次上机通常会进行多个文库测序，所以需要index来进行区分)。PCR后需要再次进行磁珠纯化，将产物与杂质分离。

图6 接头连接流程图

七、PCR产物质检

1)  用Qubit DNA HS ASSAY KIT 对PCR产物进行定量；

2)  进行2100 High SensitivityDNA Chip电泳，判断片段大小是否符合后续测序要求(片段大小一般为400bp左右)；

3)  通过Qubit定量结果和2100 chip检测出的片段大小计算摩尔浓度。

图7 文库质检图（合格）

魏祎   | 文案