2019-01-11

iTRAQ试剂配制

Solution and Reagents

1、1M DTT in frozen stock, 0.77125g溶于5ml.高纯水中，分装储存于-20℃

2、Trypsin，stock, 0.4µg /µl (Promega)

3、1M  iodoacetamide  in高纯水，1.8496g溶于10ml高纯水中，分装储存于-20℃

4、8M urea solution in.高纯水，市售8M urea溶于16ml高纯水中，分装储存于-20℃

5、50mM NH4CO3（ABC，Ammonium Bicarbonate，79.056g/mol）

      称取0.158112g固体溶于40ml 屈臣氏蒸馏水中，调节PH=8.0。

6.UA    Urae（60.06g/mol）24.024g     Tris base(121.14g/mol) 0.6057g 溶于50ml纯水中，PH Adjustment   PH=8.5

高效液相色谱柱子

高效液相色谱仪跑完液相后该如何冲洗 卸柱 关机

反向柱先用甲醇水冲洗再用甲醇保存，保存柱子一定不能有水在里面，卸柱子肯定是先关掉泵

冲柱：10%甲醇冲30min，然后用90%甲醇冲30min，最后再用纯甲醇封柱

卸柱子是要停流速的，先卸哪一端没有要求，都可以的

反相柱的标准保存方法是不含缓冲盐的1：1水-乙腈。先冲洗柱子10-20体积左右，一般也就是冲20分钟到半个小时（同时关掉柱恒温箱，让柱子自然冷却）。然后把泵流速降低（比方0.01mL/min），先拆检测器端，用一个堵头轻轻旋上（不拧死）；然后拆泵端，同时可以把另一端的堵头拧死。然后把泵端用堵头拧死即可。如果第二天还要用就不用麻烦了，直接关了恒温箱，用不含缓冲盐的50%乙腈或50%甲醇冲洗后停泵即可。

冲C18柱：5%甲醇0.5h->50%甲醇10~20min->100%甲醇0.5h 含盐流动相需加长5%甲醇冲洗时间

卸柱通常是在冲洗程序完毕，机器全部关掉的情况下再进行拆卸。

拆卸前后端次序没要求，关键是倘若有保护柱时，最好先连保护柱一起拆，然后再进行保护柱和柱子分离，再各端口扭上封口；扭子扭到最后稍微用力往反方向拔一下就能拆出来。

我的C18柱子都是先80%的水洗半个小时，再80%的甲醇冲洗半个小时。

关掉泵，压力为零后卸柱子（好像没人给我说先后顺序）。

卸完之后螺丝封上。

别的柱子好像也是这样清洗的，我们都是用的同一个冲洗方法

你应该是iTRAQ标记吧，碳酸氢铵冻干就能去除，因为冻干水分子完全挥发，碳酸氢铵也分解为氨气和二氧化碳。关键是iTRAQ标记过程还有其他盐分存在，冻干去除不了。用spin column去除盐分是不错的方法。但我遇到个奇怪的事情，spin column去除盐分，冻干后上SCX没问题，但改为在线用C18柱除盐，冻干后再上SCX就是不得。不是挂不上柱，就是分不开。所以我想请教有不有高手指点在线用C18柱除盐的方法。流动相是什么？程序如何设定？要注意什么？

C18 Cartridge 常用的流动相是0.1%TFA,洗脱用0.1%TFA+70%ACN。线用C18柱应该也差不多的吧。

做iTRAQ分级不需要脱盐的，标记结束后只需将体系用SCX loadingbuffer稀释就可以了，一般稀释4-5倍，pH调节到2.7左右，基本就可以挂SCX柱了（ Polysulfoethyl 4.6x100mm column (5?, 200?) PolyLC Inc, Maryland, U.S.A.）

超滤管的最小分子量为3KD，对肽段不太适用。C18除盐也是一个很好的方法，不过这个过程肯定会有肽段的损失。

过完SCX柱后，有许多流动相的盐 ，可以用 spin column除去