NEPA21电转染在iPS中利用CRISPRi系统发现病毒感染新

新型冠状病毒肺炎(COVID-19)是一种严重的急性呼吸道传染性疾病，其由急性呼吸综合征冠状病毒SARS-CoV-2感染所致。自COVID-19新冠肺炎疫情爆发至今，已两年有余。除了疫苗接种，目前医学界还没有针对治疗新冠的特效药问世。而关于其感染机制的研究，对于新冠药物的研发至关重要。

据报导，SARS-CoV-2的感染需要许多受体和蛋白酶。在感染期间，SARS-CoV-2刺突（S）蛋白与细胞表面表达的血管紧张素转换酶2（ACE2）结合，并被跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）等蛋白酶切割，导致S蛋白分裂为S1和S2结构域。SARS-CoV-2通过S2结构域融合和侵入细胞。因此，SARS-CoV-2感染被认为是依赖于宿主细胞中ACE2和TMPRSS2的表达。然而，除了ACE2和TMPRSS2之外的其他蛋白分子也在SARS-CoV-2感染中起着重要作用。

近期，有研究学者通过通过CRISPR/Cas9基因编辑系统和表达ACE2的人类诱导多能干细胞（iPS）检测了神经纤毛蛋白-1（NRP1）、碱性蛋白BSG、跨膜丝氨酸蛋白酶（TMPRSS）和组织蛋白酶（CTS）在SARS-CoV-2感染中的作用。该研究发现双重敲降TMPRSS2和组织蛋白酶B（CTSB）可将病毒载量降低至0.036%±0.021%。CTPB抑制剂CA-074甲酯和TMPRSS2抑制剂Camostat的组合更将病毒载量降低至0.0078%±0.0057%。这些研究结果都在四种SARS-CoV-2的变异株（β.1.3、β.1.1.7、β.1.351和β.1.1.248）中得到证实。同时使用这两种药物都可将人类男性和女性iPS中的病毒载量降低到0.01%以下。这些发现表明，对于TMPRSS2和CTSB的靶向化合物表现出高效的抗病毒效果，这可以为COVID-19的治疗药物研发提供一种思路。

为了阐明除ACE2以外的受体和蛋白酶在SARS-CoV-2感染中的功能，该研究通过使用过表达ACE2的iPS（ACE2 iPS）和CRISPRi系统抑制了BSG、CTSB和TMPRSS2基因的表达水平，并设计了针对这些基因的sgRNA。用表达sgRNAs、mKate2和抗病毒基因的质粒电转染iPS，如下图所示。

在比较通过dCas9蛋白表达抑制ACE2的iPS中目标基因的表达水平后，对细胞进行SARS-CoV-2感染，如下图所示。

结果发现CTSL、CTSB和TMPRSS2的抑制使得ACE2 iPS中的病毒RNA拷贝数分别降低至11.7%±3.77%、0.84%±0.062%和20.6%±10.4%。TMRPSS2的抑制始终减少了刺突（S）蛋白的ACE2 iPS的数量。这些结果表明，CTSB、CTSL和TMPRSS2参与了ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染。

基于上述发现，该研究团队接下来探究了CTSB、CTSL和TMPRSS2抑制剂是否能抑制ACE2 iPS中的SARS-CoV-2感染。用SARS-CoV-2感染表达ACE2的iPS后，细胞在CA-074甲酯（CA-074 Me，CTSB抑制剂）、Z-Phe-Tyr（tBu）-重氮乙基酮（CTSL抑制剂）、卡莫司他（TMPRSS2抑制剂）或纳法莫司他（TMPRSS2抑制剂）的存在下培养。

结果发现在表达ACE2的WTB CRISPRi Gen1细胞中，经CA-074 Me处理后，病毒RNA的拷贝数减少至0.62%±0.25%。在表达ACE2的1383D6细胞中，通过Camostat和Nafamostat处理，病毒RNA拷贝数分别减少至0.48%±0.023%和0.23%±0.14%。在这四种化合物中，Nafamostat对ACE2 iPS具有细胞毒性。这些结果表明，CA-074 Me或Camostat治疗可降低ACE2 iPS中SARS-CoV-2的感染效率。

最后，该研究团队检测了TMRPSS2和CTSB的双重敲降机制对于ACE2 iPS的SARS-CoV-2感染的影响作用。结果发现，感染的CTSB和TMPRSS2双基因敲降细胞中的病毒RNA拷贝数低于感染的单基因敲降细胞中的病毒RNA拷贝数，如下图所示。

CRISPR/Cas9基因编辑系统可以使用转录阻遏物结构域（KRAB）和短引导RNA（sgRNA）融合的降解蛋白Cas9（dCas9）选择性地抑制靶基因的表达。CRISPRi和iPS的组合可以将靶基因的表达抑制到1%或更低。此外，在由iPS诱导的体细胞中，该表达也保持低水平。到目前为止，利用iPS衍生的体细胞进行的SARS-CoV-2研究已得到广泛开展。

值得一提的是，为了进行CRISPRi实验，该研究团队运用的 NEPA21高效基因转染系统独特设计的电转程序，取得良好的实验结果。

参考文献

1. R Hashimoto, A Sakamoto, S Deguchi, R Yi, E Sano, A Hotta, K Takahashi, S Yamanaka, K Takayama. (2021). Dual inhibition of TMPRSS2 and Cathepsin B prevents SARS-CoV-2 infection in iPS cells, ScienceDirect, 26,1107-1114.

2. Seyran, M., Takayama, K., Uversky, V.N., Lundstrom, K., Palu, G., Sherchan, S.P., Attrish, D., Rezaei, N., Aljabali, A.A.A., Ghosh, S., et al. (2021). The structural basis of accelerated host cell entry by SARS-CoV-2y. FEBS J. 288, 5010–5020.

3. Daly, J.L., Simonetti, B., Klein, K., Chen, K.-E., Williamson, M.K., Antón-Plágaro, C., Shoemark, D.K., Simón-Gracia, L., Bauer, M., and Hollandi, R. (2020). Neuropilin-1 is a host factor for SARS-CoV-2 infection. Science 370, 861–865.

4. Cantuti-Castelvetri, L., Ojha, R., Pedro, L.D., Djannatian, M., Franz, J., Kuivanen, S., van der Meer, F., Kallio, K., Kaya, T., and Anastasina, M. (2020). Neuropilin-1 facil- itates SARS-CoV-2 cell entry and infectivity. Science 370, 856–860.

5. Wang, K., Chen, W., Zhang, Z., Deng, Y., Lian, J.-Q., Du, P., Wei, D., Zhang, Y., Sun, X.-X., and Gong, L. (2020). CD147-spike protein is a novel route for SARS-CoV-2 infection to host cells. Signal Transduct. Target. Ther. 5, 1–10

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