细胞的体检：体外细胞活力检测方法概述｜译
本文介绍各种检测活细胞和死细胞的方法，主要翻译自Abcam的产品手册：
本手册涉及的细胞活力、细胞毒性、细胞周期、细胞增殖和细胞死亡分析对大多数细胞学研究都是很重要的，是为指南。
分如下4部分介绍：
[1] 基于细胞代谢/酶活性检测的细胞活性和细胞毒性实验
持续的细胞活力检测，如代谢活性
[2] 基于细胞裂解/细胞膜完整性的细胞活性和细胞毒性实验
通过检测胞内酶的外逃或者使用膜透过性染料来检测细胞膜的损伤
[3] 细胞增殖和细胞周期实验
监测细胞群增殖，检测子细胞的生成，或者检测细胞群处于哪个细胞周期。该方法也可以用来检测细胞活性。
[4] 细胞死亡/凋亡分析实验
检测不同细胞死亡类型所表现出来的表面marker。
注意：没有完美的方法可以显示细胞的活性、增殖和死亡状态，必要时需要多种方法联用。
[1]
细胞活性和细胞毒性实验：细胞代谢和酶活性检测
有多种方法可以检测活跃状态的细胞代谢水平和酶活力。包括：
A. 可以被细胞内酶还原的染料
B. 线粒体膜电位依赖的荧光染料
C. 胞内可以被脂酶水解的荧光染料
D. 检测ATP或者ADP
E. 检测糖酵解通路以及氧消耗的方法
A.
染料还原法
四氮唑细胞活力检测法借助胞内脱氢酶将四氮唑还原为有颜色的甲臜产物，后者可以通过测定吸光值进行定量。该方法包括MTT、MTS、WST-1、WST-8和XTT等。另外一种染料刃天青是通过为线粒体呼吸链提供电子从而形成强荧光的染料，小伙伴们常用的Alamar Blue就是它了。
B.
线粒体膜电位依赖的荧光染料
有很多染料会聚集在保存还原电势的完整线粒体膜上，利用这个性质我们可以检测活细胞。膜电势下降染色也会下降，这也是检测细胞凋亡的常用方法。
A家提供的这类染料很多，TMRE/TMRM、JC-1/JC-10、Mitotracker Red、Rhodamine123、MitoNIR和MitoOrange等。其中，JC-1/JC-10是一个很有意思的染料，它在非聚集状态下是绿色的，聚集在线粒体周围就会变红。
C.
脂酶水解染料
钙黄绿素等类似的疏水性染料进入细胞后会被胞内的脂酶水解，如果细胞膜完整，这些水解后的染料就无法再出去了。Calcein AM是这类染料的代表。
D.
ATP检测法
还有一类方法是提高细胞膜的透过性使其释放ATP，并进一步检测ATP水平来测定细胞活性的。检测ATP水平比较多的方法是利用荧光素酶（Luciferase），也有用ATP依赖的磷酸化assay来检测的——不过相比较荧光素酶检测法1pM的灵敏度，磷酸化法1uM的检出限实在是太高了。
E.
氧消耗和糖酵解方法
Extracellular Oxygen Consumption Assay kit利用的是一种遇氧淬灭的染料，细胞的呼吸作用会消耗氧，相应地，染料的荧光强度会变强。在反应中该染料不会消耗，可以持续进行检测，特别适用于观察药效。
Intracellular Oxygen Concentration Assay kit原理和上述kit类似，不过可以进入到细胞内进行实时监测。
Glycolysis Assay [Extracellular acidification] kit用来检测胞外酸水平的提高， pH值下降荧光强度增强。同样也可以实时监测。
[2]
细胞活性和细胞毒性实验：细胞裂解和胞膜完整性
如果是比较严重的细胞损伤或者死亡，可以通过检测细胞膜的完整性来检测。
方法包括：
A. 检测从胞内渗出的酶的活性
B. 使用不能穿透完整细胞膜但细胞膜损伤后可以进入细胞的染料
C. 使用弱结合于活细胞表面、对死细胞强染色的氨基反应性染料
经常使用的是不能穿透完整细胞膜的染料，常用来给活细胞/死细胞混合体系中的死细胞染色。
A.
酶渗出
最常用的酶靶点是LDH（乳酸脱氢酶），LDH氧化乳酸可以产生具有可见光吸收/荧光的产物。另外一个酶靶点是AK（腺苷酸激酶），AK可以把ADP转化为ATP，后者可以用荧光素酶来检测。AK活性不如LDH稳定。
B.
膜不透过性染料
细胞活性检测常利用膜不透过性荧光染料（大多数染DNA）给细胞膜被破坏的细胞染色。在细胞活力检测中，因为发射光谱太广和倾向于染色活细胞等原因，PI（碘化丙啶）已经广泛为DRAQ7或者7-AAD所取代。
DRAQ7：Ex/Em633&647/665-800 nM；DNA染色
7-AAD：Ex/Em488/647 nM；DNA染色
PI：Ex/Em536 &617 nM；DNA染色；随时间增加易淬灭。
Ethidium homodimer-1：Ex/Em528/617 nM；DNA染色
台盼蓝：非荧光。经典的细胞计数/活力测试方法。手动操作麻烦误差大。
上文中提到的51Cr染色方法与此原理一样，不过最终检测的是同位素。
C.
氨基反应性染料
氨基反应性染料与活细胞表面的氨基反应表现出弱染色作用，但与胞内的氨基作用则表现出强荧光。同体系中死细胞和活细胞的荧光强度区分明显。
氨基反应性染料有多种Ex/Em波长可供选择。
D.
多染料叠加共染死细胞/活细胞复合体系
Ethidium homodimer（死细胞） + 脂酶水解染料（活细胞）
cell-impermeable DNA-binding dye（死细胞） + Cell Green fluorescent dye（活细胞）
[3]
细胞增殖和细胞周期实验
这类实验监测的是细胞群的增殖速率、子细胞增加或者不同细胞周期的细胞在细胞群中的比例。
A. 细胞周期检测中的DNA染料
B. 染料稀释法
C. DNA复制过程中加入核酸类似物
A.
DNA染料
多用于流式检测细胞群中DNA含量/细胞周期。最常用的还是PI。
PI上文有介绍，其他染料有：
Nuclear Green CCS1：Ex/Em 490/525 nM
Nuclear Red CCS1：Ex/Em 490/620 nM
DRAQ5：Ex/Em 663&647/665-800 nM
DAPI：Ex/Em 358/461 nM
Hoechst 33342：Ex/Em 350/461 nM
Hoechst 33258：Ex/Em 350/461 nM
7-AAD：Ex/Em 488/647 nM
B.
染料稀释法
染料稀释法基于细胞多次分裂之后染料仍然保留在母细胞内，子细胞每次获得来自母细胞一半的染料的原理，流式定量。CSFE（羟基丁二酰亚胺脂）是该方法最早使用的染料。
CSFE：Ex/Em 492/517 nM（高浓度有细胞毒性）
Cytolabel Blue/Green/Red/Orange 可选，流式、显微镜均可。
C.
核酸类似物
BrdU（溴脱氧尿甙）/EdU（乙炔基脱氧尿嘧啶核苷）实验通过检测DNA复制过程中掺入DNA的BrdU/EdU来监测细胞增殖。和必须借助抗体检测的BrdU不同，EdU可以直接和荧光染料或者生物素偶联，检测荧光或者与亲和链霉素-HRP结合后的光吸收即可。EdU染色与进一步的抗体染色具有一致性，而不像BrdU方法那么难操作。
3H-TDR（氚-胸腺嘧啶核苷）是另一种核酸类似物，使用同位素的方法来检测。
D.
其他方法
组织样品或者细胞培养液样本的细胞增殖检测，通常利用抗体检测Ki67或PCNA（肿瘤细胞增殖因子）。
还有一种虽然无法实现高通量、但不失经典的检测细胞增殖的方法：克隆形成实验——细胞以极低密度接种于孔板中，经过一段时间的培养，通过计数细胞克隆来判断增殖。
E.
衰老实验
最常用的衰老细胞的marker是胞内SA-beta-gal（溶酶体-β-半乳糖苷酶）的过表达和积累。使用分光/荧光底物可以检测beta半乳糖苷酶活性。
[4]
细胞死亡/凋亡分析实验
通过检测不同细胞死亡类型/阶段被特异性激活的marker可以判断细胞的死亡类型和进程。
方法包括
A. 结合细胞表面磷脂酰丝氨酸的Annexin V
B. DNA凝聚和断裂（TUNEL）实验
C. Caspase激活检测
D. 线粒体膜电势依赖染料
E. 细胞色素C释放实验
F. 谷胱甘肽实验
G. 坏死、失巢凋亡（anoikis）和细胞自噬的实验
A.
Annexin V实验
细胞发生凋亡的情况下，磷脂酰丝氨酸会迁移至细胞膜外表面，而可以和这个marker特异性结合的Annexin
V就作为检测细胞凋亡的理想工具（Annexin V可以偶联多种染料，如FITC、Cy3、PE等等）。通常使用流式检测。Annexin V和膜不透过性的染料如7-AAD联用，可以区分完整的凋亡的和坏死的细胞。
B.
DNA凝聚和断裂
通过DNA染色可以观察到细胞凋亡时发生的DNA凝聚现象。而DNA的断裂可以用琼脂糖凝胶的方法检测。TUNEL实验中，DNA片段的3’端标记上偶联了荧光染料或者生物素的脱氧尿嘧啶核苷，通过偶联的染料/生物素可以方便地检测到DNA片段。
C.
Caspase激活检测
激活的Caspase可以通过免疫组化、免疫印迹或者流式的手段进行检测。检测Caspase活性可以使用小肽底物（可以被细胞提取物中的Caspase水解）或者底物类似物（在活细胞中结合激活的Caspase）。前者可以使用荧光的方法检测，后者可以用流式检测。
Caspase的特异性因底物而异。
（个中细节很多，会再整理一篇文章详细说明）
D.
线粒体膜电势依赖染料
凋亡检测也可以使用那些线粒体膜电势依赖的染料（前文有述[1]-B）。因为线粒体膜电势丢失，凋亡细胞的染色很弱。
E.
细胞色素C释放实验
线粒体膜电势完全丢失后，细胞色素C会释放至细胞质。可以用ELISA、Western的方法检测。
F.
谷胱甘肽实验
如GSH/GSSG assay，利用可以和GSH反应生成强荧光产物的染料来检测反应体系中的GSH。
G.
坏死、失巢凋亡（anoikis）和细胞自噬的实验
a. 坏死、凋亡：Abcam提供kit可以同时染色坏死的、凋亡的以及活的细胞。细胞凋亡marker会再下篇文章详细讲述。
b. Anoikis：
经过处理的细胞分别铺入对照plate和anchorage resistant plate，继续培养一段时间后，加入MTT或者calcein AM或者Ethidium homodimer（前文有述）检测细胞存活/死亡情况。发生anoikis的细胞在两种plate中的表现会有差别。
c. 细胞自噬：
使用可以特异性结合细胞自噬空泡的染料与细胞共孵育一段时间，洗去未吸附的染料，然后用荧光显微镜、酶标仪或者流式进行检测。
另有一个kit，使用MDC（单丹磺酰戊二胺）和PI联用的方法检测细胞自噬/细胞死亡情况。
