基因家族分析（二）
基因家族流程：基因家族分析（一）
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数据库检索与成员鉴定
1)数据库检索：常用数据库（植物）
· TAIR: http://www.arabidopsis.org/
· phytozome ：https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html
· Ensemblplants:http://plants.ensembl.org/index.html
· Pfam:http://pfam.xfam.org/ （蛋白结构域注释的分类系统）
2)已鉴定的家族成员获取（多物种进化树需要）
1.具体家族信息可以参考拟南芥已经发表的基因家族：https://www.arabidopsis.org/browse/genefamily/index.jsp
2.按照文献中的ID从上述phytozome 等数据库中下载，下载该物种蛋白序列文件，找到对应成员。
注意：文献中的数量可能比实际少，因为数据库的更新。
3)非鉴定的家族成员获取（即基因家族分析）
文件准备：hmm，蛋白库，拟南芥目标蛋白家族序列。
比对工具：一般使用blast和hmmer。
[1] hmm文件准备：为了大家可以实操，选择拟南芥一个常见家族：14-3-3也叫GRF，如下图，下载蛋白序列为At_14_3_3.fa 。
At 14-3-3.png
1.将拟南芥14-3-3的第一个At4g09000蛋白或者已有物种的家族蛋白序列上传到phmmer search ，查看该14-3-3蛋白所含domain的hmm（如(PF00244）模型，并链接到pfam下载hmm模型。
14-3-3 domain.png
model.png
下载hmm.png
2.文献中14-3-3在pfam accession为PF00244，在pfam检索，其余方法同上。
[2] 软件hmmer和blast鉴定成员。
1. hmmer下载及安装
#以下为目前最新版本3.2.1 (13 June 2018)
$ wget http://eddylab.org/software/hmmer/hmmer-3.2.1.tar.gz
$ tar zxf hmmer-3.2.1.tar.gz -C ~/biosoft/
$ cd ~/biosoft/hmmer-3.2.1
$ ./configure
$ make
$ make check
$ echo 'PATH=$PATH:~/biosoft/hmmer-3.2.1/src/' >> ~/.bashrc
$ source ~/.bashrc
$ hmmsearch -h
Usage: hmmsearch [options] <hmmfile> <seqdb>
Options directing output:
-o <f> : direct output to file <f>, not stdout
-A <f> : save multiple alignment of all hits to file <f>
--tblout <f> : save parseable table of per-sequence hits to file <f>
--domtblout <f> : save parseable table of per-domain hits to file <f>
--pfamtblout <f> : save table of hits and domains to file, in Pfam format <f>
--acc : prefer accessions over names in output
--noali : don't output alignments, so output is smaller
--notextw : unlimit ASCII text output line width
--textw <n> : set max width of ASCII text output lines [120] (n>=120)
hmmer鉴定 ：用的南瓜蛋白数据库
pengzw@super-server:~$ wget http://pfam.xfam.org/family/PF00244/hmm
pengzw@super-server:~$ mv hmm 14-3-3.hmm
pengzw@super-server:~$ wget ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/Cucurbita_moschata/v1/Cmoschata_v1.protein.fa.gz
pengzw@super-server:~$ gunzip Cmoschata_v1.protein.fa.gz
pengzw@super-server:~$ hmmsearch -o ./14-3-3_hmm.txt 14-3-3.hmm Cmoschata_v1.protein.fa
pengzw@super-server:~$ ls
14-3-3.hmm 14-3-3_hmm.txt Cmoschata_v1.protein.fa
注意：
1.某些数据库蛋白存在可变剪切，分析要求一个基因仅保留一个represent 序列，一般都是保留最长的序列。这里拟南芥数据库有仅保留一个序列的文件，直接下载即可。
2.保留最长转录本方法：（1）CJ大神TBtools软件的Fasta Longet Representative功能。（2）python脚本：参考生信媛 。
结果如下，位于横线以上有19个成员，横线下方基本排除可能，但是我一般为了保险都要确定一下。
hmm result.png
2.blast鉴定:用拟南芥基因家族蛋白BLAST所用物种基因组，取相似性大于50%（可根据需要求修改或者文献）的序列。At_14_3_3.fa从拟南芥数据库下载整理。
pengzw@super-server:~$ makeblastdb -in Cmoschata_v1.protein.fa -dbtype prot -parse_seqids -out Cmoschata_v1.protein.db
#blast比对：
pengzw@super-server:~$ blastp -query At_14_3_3.fa -db Cmoschata_v1.protein.db -out 14-3-3.blast -evalue 1e-10 -num_threads 4 -outfmt 6 -num_alignments 5
pengzw@super-server:~$ cat 14-3-3.blast|awk '$3>=50 {print $0}' >>50.txt
结果：去除重复值，有14个结果。
blast 50%.png
3.domain确定：pfam，phmmer search ，SMART，NCBI Batch CD- search（我喜欢phmmer）。
将hmmer的结果的id整理出来，提取蛋白序列（TBtools，再一次感谢CJ大神），再提交到phmmer网站，查看是否只有一个14-3-3 domain。
phmmer.png
phmmer result.png
4.汇总结果
结合1.2.3步，命令行或者excel核对求交集，得到最终结果南瓜中有12个14-3-3家族成员。
5.总结及注意事项：
• 只有一个domain，hmmer很快，但是可能结果很多，例如MAPK、MAPKK、MAPKKK等，它们的domain都为pkinase，分族是根据进化树分支结果，这时需要结合blast结果验证。
• 两个及以上domain，需要利用检索取两个较少结果的交集，可结合blast结果验证。
