HTLV-1感染促进T细胞过度活化并转化为成人T细胞白血病/淋巴

2021年12月，来自熊本大学等研究机构合作在The Journal of Clinical Investigation 发表了“HTLV-1 infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma”的研究论文。该工作利用单细胞转录组和 TCR 测序等技术，证明了人类I型 T 细胞白血病病毒（HTLV-1）可激活 naive T 细胞转化为成人 T 细胞白血病（ATL）细胞，HTLV-1 感染的细胞上调了 HLA II 类分子表达并作为耐受性抗原提呈细胞诱导抗原特异性 T 细胞无能，从单细胞水平揭示了人类I型 T 细胞白血病病毒（HTLV-1）介导的转化和免疫逃逸机制。

研究背景

人类I型 T 细胞白血病病毒（HTLV-1）是第一个被报道的人类逆转录病毒，感染了全世界至少500万至1000万人。HTLV-1 主要感染 CD4+ T 细胞，在被感染者中诱导慢性、持续性感染，最终约有5%-10%的感染者发展为成人 T 细胞白血病（ATL）。ATL 患者的临床表现多样，可表现为白血病样的急性型、淋巴细胞增生的淋巴瘤型、预后较好的慢性型和隐袭型。HTLV-1 会改变细胞分化、激活和存活状态，然而目前尚不清楚这些变化是否以及如何促进感染细胞的恶性转化。

研究思路

研究结果

1.HTLV-1 感染个体 PBMC 的单细胞转录组分析

研究选取3例健康个体（HD）、4例无症状携带者（AC）和9例 ATL 患者（包括3例隐袭型（SML）、5例慢性型和1例淋巴瘤型），取 PBMC，进行单细胞转录组和 TCR 测序。共获得87742个细胞，聚类并鉴定得到25个群包括 T 细胞、B 细胞、NK 细胞、骨髓细胞、巨核细胞和红细胞等。为了重点研究 T 细胞分化和 ATL 转化动力学，研究者进一步将得到的46078个 T 细胞进行聚类，确定了15个细胞簇，分为4个大类：感染 ATL 细胞、感染非 ATL 细胞、未感染辅助 T 细胞和细胞毒性 T 细胞（图1）。

图1 T 细胞分群图

差异基因分析结果表明，HTLV-1 感染细胞中高表达与 TCR 和激活通路相关的基因，如 TCR 信号通路、抗原呈递和免疫检查点信号通路（图2A）。进一步评估了10个共有通路中基因的表达谱，发现受感染 /ATL 群中显著富集 HLA II 型基因（图2B）。

图2  HTLV-1 感染和ATL 细胞上调 HLA II 类基因表达

2. ATL 细胞高表达 TCR 信号下游的共刺激受体和基因

对整个 CD4+ T 细胞先后进行了典范对应分析（CCA）和拟时序分析来评估 T 细胞的活化评分和发育轨迹。CCA 分析结果显示，来自 HD 的 T 细胞显示出较低的“T 细胞激活评分”和“ Treg 评分”，而来自 SML 或 ATL 患者的细胞具有较高的评分（图3A、B）。拟时序分析结果显示未感染的辅助 T 细胞聚集在拟时间轨迹的早期，而感染/ATL 细胞聚集在拟时间轴的中间。细胞的轨迹分叉成两个不同的分支，提示存在两种表型不同的 ATL 细胞（图3C）。顶部分支的细胞上调与转录和内质网应激相关的基因，而底部分支的细胞上调了与代谢和 TNF 信号转导相关的基因（图3G）。T 细胞活化和 Treg 的 CCA 评分都沿着拟时序轨迹逐渐增加，表明健康 T 细胞向 ATL 细胞的转化涉及感染细胞的活化和 Treg 表型的获取（图3E）。

图3 CCA 分析显示 ATL 细胞获得 Treg 表型并高度活化

3. 拟时序分析揭示随着 ATL 进程，HLA II 和 Treg 相关基因表达被上调

由于 ATL 细胞之间存在较大的个体差异，可能掩盖了每个个体 ATL 细胞转化的独特动力学，因此研究人员联合了3个健康个体和单个 ATL 患者的细胞共5个数据集进行了拟时序分析（图4A），确定了 ATL 细胞的轨迹：来自 HD 的细胞主要聚集在拟时间轴的早期，而来自 ATL 患者的细胞聚集在中间和末端（图4B）。T 细胞相关基因的表达动力学结果显示，沿着拟时序轨迹，与 naive 状态相关的基因表达（CCR7）被下调，而与 HTLV-1感染（CADM1）、T 细胞激活和 Treg 表型相关的基因（IL2RA、FOXP3和CTLA4）表达被上调（图4C）。表明在正常 CD4+ T 细胞从初始状态过渡到效应状态时，拟时序的早期轨迹重现了正常 CD4+ T 细胞的发育分化途径。其后的拟时间轴显示了 HTLV-1 感染后 T 细胞的进程，在此期间被感染的多克隆细胞向高度扩增的单克隆细胞过渡（图4B、4C）。

图4 单个 ATL 样本拟时序分析

为了确定导致 ATL 发展的共同因素，研究人员评估了每个数据集 Top200 基因的表达，发现这些基因富集到了一些共同的途径，如参与 IFN 和 TCR 信号转导和 HLA II 类抗原呈递。所有 ATL 患者均表达多个 HLA II 类基因（图5A、B），这些基因的表达沿拟时间轴升高，表明随着 T 细胞向 ATL 细胞转化，HLA II 类基因的表达升高（图5C）。

HLA II 类分子主要存在于单核细胞或 B 细胞等抗原提呈细胞（APC）s 中，但它们在 T 细胞中的表达也可在刺激下上调。为了探讨这种上调的意义，研究人员比较了 APC 和不同 T细胞群之间 HLA II类基因的表达水平。结果显示少数未感染的 T 细胞表达 HLA II 类基因，在 HTLV-1 感染的细胞中表达 HLA II 的细胞的百分比增加，在 ATL 细胞中达到最高（图5D）。

图5 HLA II 基因的表达沿拟时序轨迹上调

为了确定上述拟时序分析是否重现了疾病进展的实时过程，研究人员使用一对纵向样本与健康个体的样本进行轨迹推断（图6A）。拟时序分析结果显示，第一个时间点的细胞分布在拟时间轴的中间，第二个时间点的细胞主要聚集在拟时间轴的末端（图6B），说明第二个时间点的 ATL 细胞具有更极端的激活表型。RNA 速率分析也显示了类似的模式，细胞从初始状态和记忆状态过渡到受感染的细胞，进一步支持了拟时序分析结果（图6C）。HLA II 类及其相关基因的表达也显示出拟时间轴上的显著增加（图6D），证实了 HLA II 类基因表达上调是 ATL 进展的一个关键特征。

图6 成对 ATL 样本的拟时序分析

有趣的是，在拟时间轴的末端细胞轨迹出现了两个不同的分支，表明患者这两个分支中的 ATL 细胞有很大的差异（图6B）。顶部分支的 T 细胞主要表达与 TNF 介导的信号通路和细胞粘附相关基因，而底部分支的 T 细胞主要表达与 T 细胞活化和免疫信号传导相关的基因（图6E、F）。

随后，研究者对2个分支进行了 TCR 分析，发现2个分支中的 ATL 细胞起源于同一个 TCR 克隆（图6B）。对 HTLV-1 感染细胞（CADM1+CD7–/+）分选并进行了基因组分析发现在这两个时间点上，只有1个显著扩展的克隆，表明 ATL 细胞起源于同一个克隆（图6G，饼图）。对分选的细胞进行了外显子测序，鉴定了 ATL 细胞中存在的体细胞突变并描绘了2个时间点之间不同的体细胞突变（图6G）。进一步分析了 scRNA-seq 数据中这些变异等位基因的频率，发现在2个分支之间没有发生突变（图6H），表明2个分支中的细胞之间的差异是由于表观遗传修饰、代谢状态和/或其对环境信号的反应性引起的。

4 HLA II 类基因表达与 HTLV-1 感染和病毒蛋白 Tax 相关

通过流式细胞术检测发现 HLA II 类基因表达水平在 HTLV-1 感染/ATL 细胞中显著上调，但在 APC（CD14+ 单核细胞）中表达最高（图7A-C）。已知 HTLV-1 病毒基因 Tax 和 Hbz 具有致癌功能, 为了确定诱导 HLA II 类基因表达上调的基因，研究人员分别用含有 HTLV-1 Tax、HTLV-1Hbz 或 HTLV-1Nef（对照）的质粒转染 Kit225 细胞，发现只有 Tax 转染细胞中 HLA II 分子表达显著上调（图7D），表明病毒蛋白 Tax 可促进 HTLV-1 感染期间 HLA II 类基因的表达上调。

图7 HLA II 类分子表达与 HTLV-1感染及病毒蛋白 Tax 相关

5. HTLV-1 感染细胞可将抗原呈递给应答 CD4+ T 细胞，并诱导无能相关基因。

为了研究表达 HLA II 类基因的 HTLV-1 感染细胞能否向 T 细胞呈递抗原，研究人员建立 HLA II 人类白细胞抗原 TCR 刺激体外模型，使用对癌睾丸抗原 Wilms 肿瘤蛋白1（WT1）具有特异性的 HLA-DP4 限制性 TCR（克隆9）来评估 HTLV-1 感染的 CD4+ T 细胞的抗原呈递能力。结果表明 HTLV-1 感染的 CD4+ T 细胞能够向 CD4+ T 细胞呈递抗原，但它们是低效的 APC，不能完全激活 CD4+ T 细胞（图8 A-C）。研究人员进一步评估抗原特异性刺激对无能关键基因表达的影响，发现与含有 B 细胞和单核细胞的非 T 细胞相比，HTLV-1 感染的 CD4+ T 细胞的 TCR 刺激引起无能相关分子表达的增加（图8B、D）。提示 HTLV-1 感染的细胞能够上调 HLA II 类分子表达来呈递抗原，使 T 细胞无能逃避体内免疫监视。

图8 HTLV-1 感染细胞可将抗原呈递给应答 CD4+ T 细胞，并诱导无能相关基因 图9 ATL 细胞免疫抑制特性的模型

结论

基于单细胞测序数据，该研究提出了两个模型来解释 HTLV-1 感染的细胞如何逃避宿主免疫系统监视（图9），HTLV-1 感染利用了 T 细胞活化的生理机制和内环境稳态。为在 ATL 白血病发生的初始阶段将 HTLV-1 感染的 CD4+ T 细胞转化为 ATL 细胞提供了模型，并展示了受感染的克隆如何在体内经历恶性转化。

参考文献：

Tan B J Y, Sugata K, Reda O, et al. HTLV-1 infection promotes excessive T cell activation and transformation into adult T cell leukemia/lymphoma. Journal of Clinical Investigation, 2021, 131(24): e150472.