NGS016 单细胞测序（下）
第一部分详见： NGS015 单细胞测序（上）
3 单细胞平台介绍
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3.1 Missionbio Tapestri Plateform
3.1.1 工作机理
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Library preparation
3.1.2 细胞悬液准备
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3.1.3 单细胞制备
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3.2 10× Genomics
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3.2.1 Next GEM technology
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GEM指的是“Gel bead in EMulsion”液滴，它包裹 了Chromium系统内的每个微反应
Single Cell 3’ v3 Gel Beads
基于GemCode技术的Chromium系统在几分钟内将样品包裹到数百到数万个单独的且可追溯的微滴 中，每个微滴都包含一个可识别的条形码标签序列，便于下游分析。 将数以百万计的、带有寡核苷酸条形码标签的凝胶珠（Gel Bead） 与样品混合——样品可以是高分子量（HMW）DNA、单细胞、经Feature Barcoding技术标记的细胞、细胞核、经转座酶处理的细胞核或细胞珠 （Cell Beads）。随后将凝胶珠和样品加入油-表面活性剂 溶液中，以产生GEM（Gel Beads in EMulsion），GEM作为单独的反应囊泡，凝胶珠在其中溶解，样品在其中被加上标签。将带有标签的 产物混合，进行下游反应，从而产生与短读长测序仪兼容的文库。测序 后，将带有标签的短读长序列交给交钥匙分析软件的分析流程，软件可 利用标签将序列定位到最初的高分子量DNA、单细胞或单细胞核。
3.2.2 Feature barcoding technology
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3.3 DNBelab C4 便携式单细胞系统
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3.3.1 核心技术
DNBelab C系列单细胞文库制备技术
- MGI自主设计的捕获微珠
- 平均单个微珠胞含107 捕获序列 ，高效捕获mRNA
- 高效破乳回收系统 ，有效提升微珠回收效率
DNB纳米球测序技术
- 低扩增错误累积
- 低重复序列率
- 低标签跳跃
3.3.2 C4 Workflow for single cell RNA-seq
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3.4 illumina&biorad ddSEQ System
原理及流程
The SureCell WTA 3ʹ Library Prep Kit
3.5 BD Rhapsody system
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3.6 Takara ICELL8
3.6.1. SMARTer® ICELL8® Single-Cell System
3.6.1.1 流程
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3.6.1.2 特点
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- 通量高：一次最多可以分选1800个单细胞
- 适用范围广：细胞分离无偏好性，适合分析各种大小的细胞
- 高度自动化：先进的成像系统便于快速挑选特定细胞
- 更少成本更高实验效率：只挑选感兴趣的细胞用于后续分析
- 更低的技术错误：一次最多可以同时分选8个细胞样品
- 更高的实验灵活性：可满足不同实验需求
3.6.2 ICELL8® cx Single-Cell System
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CELL8 cx Single-Cell System是一款先进的集成自动化平台，它将成像功能与分注功能进行组合，可直接完成5,184-纳米孔芯片分离单细胞的全过程。该系统装配了大口径分配器，可以完成无细胞大小偏好的单细胞分离。成像功能可以对单细胞与多细胞进行区分。此外，通过使用荧光技术并结合细胞染料，还可以完成对活细胞/死细胞的分析
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3.7 Fluidigm C1
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特点
利用微流体芯片技术，自动完成最多 800 个单细胞的捕获、裂解、逆转录、 预扩增和产物回收
专门制备单细胞核酸样本的自动化系统，速度快、成本低，数据重复性好、可信度高
适用于 BioMark HD 系统的基因表达分 析和 NGS 的转录组分析及 DNA 分析
提供与细胞大小相适合的 IFC（Integrated Fluidic Circuit）芯片
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3.8 平台对比
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4 单细胞应用
4.1.1 单细胞文献数目统计
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4.1.2 单细胞测序主要应用方向
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4.1.3 单细胞难点分析
实验技术重难点
- 单细胞分选技术都需要大量的细胞样本，这对于一些难以获取的珍稀样本并不友好。
- 目前大多数的高通量转录组平台只能实现 3’或者 5’端测序，无法获取更为丰富的全长转录本信息
- 单细胞由于 DNA 和 RNA 含量都是皮克级别，因而检测到的总基因数相对较低，而且在扩增过程中由于捕获效率的问题，仍然会存在着扩增偏向性问题
- 单细胞表观组学方法是发展相对不成熟的技术，如scATAC-seq 技术上存在较低的文库复杂度，对组织解析高敏感度等问题，单细胞甲基化测序技术存在着低通量和基因组覆盖率较低的问题。
单细胞测序数据处理较难 - 与传统测序相比，单细胞测序会产生更大的背景噪声数据，因为单细胞的 DNA或 RNA起始量太小，扩增和捕获时微小的偏差经过多重扩增后会被放大
- 不同样本间产生的批次效应也是处理单细胞数据时的一个难点。
目前大部分单细胞数据分析都是基于编程语言如 R 语言，Python 等，这在实验人员和生物信息分析人员之间造成了一定的壁垒
