0.单细胞常见问题系列
Q: res设置？0.4~1.4等的选择上有啥讲究没有呢？
A: 个人习惯！没有，分辨率越高分的越细，如果生物学背景知识可以判断，可以随意设，如果不行，结合markers和tree判断。
分辨率选择
Q: 这种情况对结果有没有影响呢?
A：没有！细胞名字几乎没有影响，主要是你的meta表格。
meta预设信息
Q: meta必须设置么 好像有些分析中也可以不要?
A: 看你需要,如果哦没有任何预设，meta也不重要,后续的信息都会存到meta里。
Q：数据库推荐（关于marker）？
A：cell marker CellMarker (hrbmu.edu.cn)，比较准确；
其他还有mouse cell atlas MCA | Mouse Cell Atlas (zju.edu.cn)；
肺的数据可以参考lunggens数据库LungGENS (cchmc.org)，lunggens就是lungmap里面的；
PanglaoDBPanglaoDB - A Single Cell Sequencing Resource For Gene Expression Data，可以和cellmarkers相互补充印证，该网站基于RNAseq和实验数据出发的，但我实践发现没有cellmarkers准，非常奇怪，所以我认为RNAseq的表型只是大家愿意描述的那一种（可以用来看不确定的细胞类型）；
Cell Markers (biolegend.com)基于纯实验的markers，不区分组织，仅区分细胞，所以这个网站的markers都是广谱的。
Q: FindVariableFeatures（高可变基因）和FindMarkers（差异表达基因）的区别?
A: 1. FindVariableFeatures()–特征选择:
高变异基因就是highly variable features（HVGs），就是在细胞与细胞间进行比较，选择表达量差别最大的基因，Seurat使用FindVariableFeatures函数鉴定高可变基因，这些基因在不同细胞之间的表达量差异很大（在一些细胞中高表达，在另一些细胞中低表达）。默认情况下，会返回2,000个高可变基因用于下游的分析，如PCA等。利用FindVariableFeatures函数，会计算一个mean-variance结果，也就是给出表达量均值和方差的关系并且得到top variable features,这一步的目的是鉴定出细胞与细胞之间表达量相差很大的基因，用于后续鉴定细胞类型。
A: 2. FindMarkers()–寻找差异表达基因:
Seurat使用FindMarkers和FindAllMarkers函数进行差异表达基因的筛选
两篇很好的单细胞分析问答贴Confusion about FindMarkers(), FindVariableFeatures(),RunTSNE(), and RunUMAP() in seurat package：https://www.biostars.org/p/406388/ ; https://www.jianshu.com/p/5a06ebfba7bd
分析过程反复执行命令（如RunPCA）有没有什么影响？
在单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据分析过程中，RunPCA 是一个常见的步骤，用于降维处理数据。反复执行 RunPCA 可能会带来以下影响：
- 结果的一致性：
- 理论上，如果你在相同的输入数据上多次运行 RunPCA，结果应该是一致的，尤其是在没有进行其他数据处理步骤或参数调整的情况下。
- 但在一些实现中，PCA 可能依赖于某些随机初始化步骤。如果没有设定随机种子（random seed），每次运行的结果可能会有微小的差异。这种差异在后续步骤中可能会被放大。
- 计算资源的浪费：
- 反复执行 RunPCA 会占用计算资源，增加运行时间，而在相同的数据集和参数下，多次运行通常是不必要的。
- 建议在一次运行后保存 PCA 结果，避免重复计算。
- 数据处理链的复杂性：
- 如果在不同的处理中改变了数据（例如过滤细胞、基因，或者进行了归一化），那么每次运行 PCA 的结果可能不同，这取决于输入数据的变化。你需要确保输入数据的一致性，才能比较多次运行的 PCA 结果。
- PCA 维度选择：
- 在运行 PCA 时，通常会选择保留前几个主成分（PCs）。每次运行 PCA 时，如果数据略有不同，最有解释力的主成分可能会有一些变化。这对下游分析（如聚类分析或 UMAP/t-SNE 降维）可能有影响。
最佳实践建议：
- 设置随机种子：为了确保结果的一致性，建议在运行 RunPCA 时设置一个固定的随机种子。
- 保存结果：在第一次运行后保存 PCA 结果，可以避免重复计算。
- 保持数据一致：如果在不同步骤之间改变了数据集，确保每次 PCA 的输入数据集是你想要的，以便得到可比较的结果。
总结来说，反复执行 RunPCA 本身并不会对结果产生重大影响，但在保证计算资源的有效利用和结果的一致性方面，还是应该小心处理。
