改造IGV （八）- 基于RNAseq测序数据 - 人工进行基因

写在前面

课题组目前做一些基因组相关工作。了解基因组的朋友应该明白，基因结构注释错误几乎遍布所有基因组，包括我们目前看到的大多数即使是发表在顶级期刊的工作。生物是复杂的，而算法是存在局限的。所以人工矫正基因结构注释往往是最终选择之一。目前，市面上基本只有一个工具可以做到，那么是一款叫做Apolle Browser的浏览器。现在已经是第二代【第一代似乎已经无法下载到】，一个常用的网页基因组浏览器JBrowser的一个插件实现。配置起来并不方便，涉及到各类软件的安装。所以最好的选择或许还是直接使用IGV。本文提到的改造，没有之前IGV-sRNA的改动大，主要原因是，我失败了。不过这并不影响目的的基本达成【失败只是相对于暂时定位过高的目标】。以下，直接讲述操作，作为课题组师弟师妹的使用指引。

主要分为三步：

1. IGV中定区间，指定基因ID
2. TBtools中转换输出的文件为gff3格式【即是最优基因结构注释】
3. 替换原始GFF3文件对应的内容

第一步 - IGV中定区间

我写工具，往往会考虑操作的难度。所以要求用户在IGV中定区间，我做了一些简单的东西，使得用户可以相对轻松的完成。
如下
可以看到这是一个错误的注释，或者是没注释出来。换句话说，其中已有的那个注释，本身很可能是一个错误的注释。

首先，使用IGV的区间工具，选中几个区间，你可以一次选择一个外显子，也可以使用多个有重叠的区间，覆盖一个外显子（后续会自动合并）。
如下，我分几步走，先用短的覆盖边界

随后，我继续使用区间工具，增加一些跟以上区间重叠的外显子区间

在Region Navigator中可以看到

这个窗口一般不关闭，完成一个基因之后，我个人的建议是，先Assign成一个基因，首先是选中这些区间，然后点击Assign

然后关闭小窗口，那么就会直接Assign一些信息上去
注意，其中GeneName必须是唯一的，Positive是转录本在正反链，我们用的是链特异，所以这些是负链的基因，Coding与否，你要有自己的判断，我是直接截取这个区间，BlastX到NCBI，看了下，知道这个是Coding

针对每一个基因，可以一直重复一个操作。那么就会有一系列的基因

第二步

完成了你人工矫正的步骤之后，在IGV中导出regions.bed

随后，打开TBtools

将文件设置进去，注意到必须输入文件是一个，即regions.bed
如果你的是Coding的基因，那么最好是也输入基因组序列文件，这样TBtools会自动判断并输出CDS的Feature；如果没有基因组序列文件，那么就不会有CDS feature，即使你输入的是Coding的。

点击Start，会在非常短的时间内完成。

这个生成的gff3文件，可以直接导入到IGV

于是，我们完成了基因的结构注释人工矫正。

我们手上的IGV是已经改造过的。所以，我们这个时候还可以做一个有趣的事情，直接点击对应的转录本

随后打开TBtools，黏贴进去

是的，你点击了一下转录本，就直接在剪切板中得到了全长CDS【这个功能是前几天我增加进去的】。
于是你还得到了对应的蛋白序列，找个公共数据库BlastP

可以看到，我们确实完成了一个正确的基因结构注释的人工矫正。
荔枝基因组从此多了一个基因注释。

写在后面

当然，还有第三步，那么就是替换gff3，但是...暂时懒得写了。以后再算吧。