CRISPR-Cas9基因编辑2--gRNA设计（下）

简介和前期文章

我对之前的所有教程进行了再次详细的总结
CRISPR-Cas9基因编辑之背景介绍及gRNA设计（上）

前言：

在上一次文章中，我们已经得到了在线工具设计的sgRNA序列，经由简单评估后选择出合适的sgRNA

1. 使用Snapgene anneal oligo

以上一次文章查到的PTEN knockout cell line 为案例，根据给出的PTEN sgRNA，完善oligo序列，并再Snapgene软件中匹配出来

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使用Snapgene一键生成oligo，Actions--Anneal Oligos

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粘贴事先准备好的序列--保存Oligo文件

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2. 使用Snapgene模拟插入质粒后的情况

（1）打开一个pSpCas9质粒--actin--restriction cloning--insert fragment

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（2）在Vector选项卡，选择内切酶为BbsI，在insert部分选择上一步中保存好的oligo，最后点击clone，保存DNA文件。

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（3）打开插入后的质粒图谱，检查oligo插入情况，无误后可提交上表中的PTEN-Oligo.Top/Bottom至公司合成。

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3. 设计检测所需引物

这里检测所用的引物和平时做PCR检测mRNA表达的引物是不同的，这里的PCR产物必须覆盖基因编辑的位置，且产物要足够长，至少500 bp。在这里我们以P53为例子：

（1）找到包括sgRNA序列的前后1000个碱基的序列（2000 bp）

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（2）将找到的序列复制粘贴到blast中https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/

设置参数

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（3）得到结果（小测试，为何得到的引物只有两对，而且似乎有一对还偏离中心很远，请问应该如何设置，使得产物聚集在中心？）

image.png ![image.png]

（4）查看引物基本情况，检查无误可提交公司合成

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结语：以上，我们则是完成了sgRNA及引物设计，提交公司合成，拿到之后则可开始正式实验了，感兴趣的同学，可以完成上面的小测试，有问题请在下方留言，拜拜~