RT-PCR：荧光定量pcr从入门到分析

定量pcr有两种：

1. 荧光，通过染料里的荧光，随着pcr产物的增多，而出现光信号的差异。通过激发光的差异，来分析每个孔的样品的产物的量的差异。
   代表染料：Takara RR820A/B
   说明书下载地址密码：hdum
   2.探针法：
   代表染料：百泰克的染料
   我们一般使用的是Takara的染料。

定量pcr仪是：伯乐的CFX96
定量软件：Bio-rad CFX manager 3.1
标准的CQ值范围：18-28之间
CQ值代表的是循环数，CQ值越大，表达量越低。
排板的方法：
1.横向基因纵向样本

sample1_repeat1	sample1_repeat2	sample1_repeat3	内参重复1	内参重复2	内参重复3
样本1	样本1	样本1	样本1	样本1	样本1
样本2	样本2	样本2	样本2	样本2	样本2
样本3	样本3	样本3	样本3	样本3	样本3
样本4	样本4	样本4	样本4	样本4	样本4
样本5	样本5	样本5	样本5	样本5	样本5
样本6	样本6	样本6	样本6	样本6	样本6
样本7	样本7	样本7	样本7	样本7	样本7
样本8	样本8	样本8	样本8	样本8	样本8

2. 横向样本纵向基因
   上表格式转置。
   pcr程序一般采用两步法：

定量软件Bio-Rad CFX Manager3.1的使用

1.安装该软件
下载地址 提取码: ppa2

2. 运行桌面快捷方式

   
   image.png
   image.png
   image.png
   

   然后点击开盖，自动打开pcr仪盖子，放入96孔板，点击关盖。点击protocol。

   
   image.png
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   修改pcr反应时间，反应体系体积10ul
   image.png
   然后就是next-next-run
   

   点击run,之后会弹出界面保存运行文件的位置，选择一个位置，命名好对应的样本基因编号就可以运行了。

3. 运行结果导出
   程序运行完成后，会出现如下界面：

   
   image.png
   

   点击Export->Export All data->Excel 2007
   会弹出保存到文件夹地址的框

   
   image.png
   选择之前选择的创建文件时的文件夹保存。之后会在该文件夹生产一系列文件。
   image.png
   其中admin_2019-03-12 09-56-20_第三批第2板 - Quantification Cq Results.xlsx是我们要的定量的结果。
   

   该文件的内容格式如下：

   
   image.png
   Cq值这一列是我们要的下机数据。

定量结果分析：

一般使用2^(-ののt)法：
Excel模板算法模板密码：h068
R语言算法

说明：（二选一即可）

• excel算法是自己整理数据套模板。
• R语言算法是R计算的，需要自己修改部分参数。