RT-PCR：荧光定量pcr从入门到分析

定量pcr有两种：

1. 荧光，通过染料里的荧光，随着pcr产物的增多，而出现光信号的差异。通过激发光的差异，来分析每个孔的样品的产物的量的差异。
   代表染料：Takara RR820A/B
   说明书下载地址密码：hdum
   2.探针法：
   代表染料：百泰克的染料
   我们一般使用的是Takara的染料。

定量pcr仪是：伯乐的CFX96
定量软件：Bio-rad CFX manager 3.1
标准的CQ值范围：18-28之间
CQ值代表的是循环数，CQ值越大，表达量越低。
排板的方法：
1.横向基因纵向样本

2. 横向样本纵向基因
   上表格式转置。
   pcr程序一般采用两步法：

定量软件Bio-Rad CFX Manager3.1的使用

1.安装该软件
下载地址 提取码: ppa2

2. 运行桌面快捷方式

   
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   然后点击开盖，自动打开pcr仪盖子，放入96孔板，点击关盖。点击protocol。

   
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   修改pcr反应时间，反应体系体积10ul
   image.png
   然后就是next-next-run
   

   点击run,之后会弹出界面保存运行文件的位置，选择一个位置，命名好对应的样本基因编号就可以运行了。

3. 运行结果导出
   程序运行完成后，会出现如下界面：

   
   image.png
   

   点击Export->Export All data->Excel 2007
   会弹出保存到文件夹地址的框

   
   image.png
   选择之前选择的创建文件时的文件夹保存。之后会在该文件夹生产一系列文件。
   image.png
   其中admin_2019-03-12 09-56-20_第三批第2板 - Quantification Cq Results.xlsx是我们要的定量的结果。
   

   该文件的内容格式如下：

   
   image.png
   Cq值这一列是我们要的下机数据。

定量结果分析：

一般使用2^(-ののt)法：
Excel模板算法模板密码：h068
R语言算法

说明：（二选一即可）

• excel算法是自己整理数据套模板。
• R语言算法是R计算的，需要自己修改部分参数。